microRNA98靶向N-RAS調(diào)控涎腺腺樣囊性癌惡性生物學行為的研究.pdf

1、目的：
　　探討 miR-98在涎腺腺樣囊性癌組織和癌旁組織、高/低轉(zhuǎn)移細胞系中的表達差異及其對腺樣囊性癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，通過生物信息學軟件尋找miR-98的潛在靶基因并初步探討 miR-98參與調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的作用機理。
　　方法：
　　1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌中的表達及其對涎腺腺樣囊性癌細胞惡性生物學行為的影響：通過real-time PCR檢測3例新鮮涎腺腺樣囊性癌組織以及癌旁正常組織、高

2、轉(zhuǎn)移細胞系A(chǔ)CC-M以及低轉(zhuǎn)移細胞系SACC-83中miR-98的表達水平。采用lipofectamine2000介導轉(zhuǎn)染miR-98mimics使miR-98過表達，并通過RT-PCR驗證。通過MTT實驗檢測細胞增殖能力的變化，流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化，劃痕實驗、趨化運動實驗檢測遷移能力變化，Transwell檢測侵襲能力變化，Western blotting檢測遷移相關(guān)蛋白的表達變化。
　　2、miR-98靶向N-RAS通

3、過RAS信號通路調(diào)控涎腺腺樣囊性癌的作用機理：采用生物信息學軟件TargetScan、PicTar、miRbase等對miR-98潛在的靶基因結(jié)合位點進行分析，發(fā)現(xiàn)N-RAS基因mRNA的3，非翻譯區(qū)中多個軟件預(yù)測的共同結(jié)合位點區(qū)域。構(gòu)建包含結(jié)合位點的野生型熒光素酶報告基因載體WT-NRAS-PGL3-control及突變型的熒光素酶報告基因載體MUT-NRAS-PGL3-control。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C N-RAS是 miR

4、-98的靶基因。miR-98mimics轉(zhuǎn)染細胞調(diào)高miR-98的表達水平后，Western blotting以及免疫熒光技術(shù)檢測N-RAS的表達變化， Western blotting檢測N-RAS蛋白的表達變化以及下游MAPK/ERK信號通路中ERK、p-ERK和PI3K/AKT信號通路中AKT、p-AKT的表達變化。收集我院涎腺腺樣囊性癌石蠟標本43例及臨床病理資料，免疫組織化學檢測涎腺腺樣囊性癌石蠟標本中N-RAS的表達情況，并

5、與臨床病理因素行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌組織和高轉(zhuǎn)移細胞系中的表達水平顯著低于癌旁正常組織和低轉(zhuǎn)移細胞系 SACC-83，差異具有統(tǒng)計學意義。以 ACC-M作為細胞模型，轉(zhuǎn)染miR-98 mimics調(diào)高miR-98的表達水平；MTT結(jié)果顯示miR-98過表達后，細胞的增殖能力受到抑制；平板克隆實驗結(jié)果顯示細胞的克隆形成率下降；流式細胞術(shù)提示S期的細胞明顯減少，而G0/G1期的細胞明顯增

6、多，表明細胞被阻滯在G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化進程中；劃痕閉合延遲、趨化實驗穿膜細胞數(shù)減少，細胞的遷移能力下降；Transwell小室穿過基質(zhì)的細胞數(shù)減少，細胞的侵襲能力下降；Western blotting檢測遷移相關(guān)蛋白，E-cadherin的表達上調(diào)，N-cadherin、Vimentin的表達下調(diào)。
　　2、生物信息學軟件TargetScan、PicTar、miRbase分析結(jié)果顯示N-RAS是miR-98的靶基因之一，3個

7、靶基因數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果顯示的其結(jié)合位點均含有位于N-RAS基因3，端的186-192的堿基序列。miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后48h，RT-PCR驗證miR-98在轉(zhuǎn)染組中的表達水平上調(diào)；Western blotting結(jié)果顯示miR-98過表達后N-RAS蛋白的表達水平下降；免疫熒光結(jié)果顯示 N-RAS的表達定位于細胞漿，miR-98過表達后胞漿的熒光信號減弱。雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)miR-98能夠顯著抑制野生型報告基因載體 W

8、T-NRAS-PGL3-control的熒光素酶活性，而對突變型報告基因載體MUT-NRAS-PGL3-control的熒光素酶活性沒有影響。miR-98 mimics轉(zhuǎn)染后48h，提取總蛋白，Western blotting結(jié)果顯示miR-98過表達后MAPK/ERK信號通路中ERK蛋白的表達水平不變，而p-ERK蛋白的表達水平下調(diào)；PI3K/AKT信號通路中AKT蛋白的表達水平不變，而p-AKT蛋白的表達水平下調(diào)。N-RAS在涎腺腺

9、樣囊性癌組織中主要在胞漿中呈陽性表達,其陽性表達率為83.7％(36/43), N-RAS的表達水平與臨床分期、腫瘤大小相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、組織分型、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、miR-98在涎腺腺樣囊性癌中呈低表達狀態(tài)。miR-98通過阻滯細胞周期中G0/G1期向 S期的轉(zhuǎn)化進程，抑制涎腺腺樣囊性癌細胞的增殖能力，并且抑制 ACC-M細胞的遷移和侵襲能力。
　　2、N-RAS是miR-9