整合素αvβ6調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 結(jié)腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤,隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的提高和人民群眾膳食結(jié)構(gòu)的變化,其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)。傳統(tǒng)的外科手術(shù)雖然是治療結(jié)腸癌的最有效手段,但由于結(jié)腸癌發(fā)病的隱匿性和癥狀的不典型性,很多患者就診時(shí)已達(dá)中晚期,錯(cuò)過了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。因此,化療成為了中晚期結(jié)腸癌首選輔助治療方案。遺憾地是化療會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng),患者不易耐受。如何在確保治療效果的前提下減少不良反應(yīng),是當(dāng)前和今后一段時(shí)間內(nèi)治療中晚期

2、結(jié)腸癌的研究熱點(diǎn)。在此背景下,傳統(tǒng)中醫(yī)中藥所具有的抗癌作用強(qiáng)、不良反應(yīng)小、患者易耐受的特點(diǎn)逐漸受到了人們的重視。
　　 去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)是中藥斑蝥的提取物。國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院臨床觀察證實(shí),將NCTD和常規(guī)化療方案聯(lián)合應(yīng)用治療晚期結(jié)腸癌與單獨(dú)化療相比,不但近期療效好,不良反應(yīng)輕,而且中位生存時(shí)間延長(zhǎng),生活質(zhì)量明顯提高。NCTD已經(jīng)成為晚期結(jié)腸癌一線化療的最優(yōu)輔助用藥。NCTD如何發(fā)揮抗癌作用,目前雖有

3、各種解釋,但尚無決定性結(jié)論。
　　 整合素是一類細(xì)胞表面黏附因子,由α和β兩種亞基通過非共價(jià)鍵連接而成,構(gòu)成了細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白之間結(jié)構(gòu)與功能的橋梁。αvβ6是一種特殊的整合素亞型,在健康人上皮組織中不表達(dá)或極少量表達(dá),但在胚胎形成、損傷修復(fù)和一系列上皮來源的惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。目前,關(guān)于整合素αvβ6在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用研究取得了豐碩的成果,尤其是在結(jié)腸癌研究方面更加突出。已有文獻(xiàn)報(bào)道,整合素αv

4、β6可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲,誘導(dǎo)其抵御凋亡,增強(qiáng)癌細(xì)胞成瘤能力,對(duì)結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展具有明顯的調(diào)控作用。
　　 我們前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),NCTD具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ6的藥理作用。本研究(第一部分)是在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上深入探討NCTD抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的具體機(jī)制,并為根據(jù)此藥理機(jī)制開發(fā)新型靶向藥物提供理論依據(jù)。
　　 一直以來,關(guān)于腫瘤的起源問題,醫(yī)學(xué)界始終存在兩種理論:隨機(jī)理論認(rèn)為所有腫瘤細(xì)胞的形狀、大小及體

5、積都是相同的,任何一個(gè)瘤細(xì)胞都可分化形成新的腫瘤,但其發(fā)生過程是一些低概率的隨機(jī)事件。等級(jí)理論則認(rèn)為,在所有腫瘤細(xì)胞中只有極其少量的細(xì)胞可以分裂形成新的腫瘤。這些少量的具有可分裂增殖能力的細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞。它具有自我更新和分化能力,是腫瘤不斷生長(zhǎng)、侵襲遷移的根源。目前腫瘤干細(xì)胞理論得到了越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。結(jié)腸癌干細(xì)胞是消化系統(tǒng)惡性腫瘤中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞。
　　 按照腫瘤干細(xì)胞理論,腫瘤組織中干細(xì)胞的持續(xù)存在與腫

6、瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)；腫瘤干細(xì)胞大多處于G0/G1靜止期,對(duì)化療藥物的耐受性遠(yuǎn)強(qiáng)于快速增殖期的其它腫瘤細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞所特有的成瘤能力是惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。結(jié)合我們前期在組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)整合素αvβ6的結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出的抵御凋亡、增殖侵襲和成瘤能力與腫瘤干細(xì)胞的強(qiáng)耐藥性、無限增殖、高致瘤性等特性相一致。本研究(第二部分)初步探討整合素αvβ6在結(jié)腸癌干細(xì)胞上的表達(dá)情況,明確其作為結(jié)腸癌干細(xì)胞新型表

7、面標(biāo)記的可能性,為分選、鑒定并深入研究該類細(xì)胞的特性奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 第一部分
　　 去甲斑蝥素通過αvβ6-ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的
　　 研究去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的藥理學(xué)機(jī)制。
　　 方法
　　 利用MTT法檢測(cè)NCTD對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)；明膠酶譜分析NCTD對(duì)結(jié)腸癌HT-

8、29細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)量的影響；BiotrakMMPs活性檢測(cè)NCTD處理后結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的MMPs活性變化；Hoechst33258熒光染色檢測(cè)NCTD處理后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡程度；流式細(xì)胞檢測(cè)NCTD對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞表面多種整合素表達(dá)情況的影響；MTT檢測(cè)多種功能性阻抗對(duì)NCTD處理后HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:Western blotting分析NCTD對(duì)HT-29細(xì)胞內(nèi)各種絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)表達(dá)量及磷酸化程度

9、的影響:MTT檢測(cè)多種MAPK抑制劑對(duì)NCTD處理后HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCTD對(duì)αvβ6-ERK直接連接的影響。
　　 結(jié)果：
　　 NCTD能明顯抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長(zhǎng),且這種抑制效應(yīng)與藥物濃度和作用時(shí)間正相關(guān):NCTD能夠抑制HT-29細(xì)胞MMP-9分泌及活性,但對(duì)MMP-3無明顯抑制效應(yīng)；NCTD能夠誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡,60μmol/L NCTD處理12小時(shí),細(xì)胞凋亡率即達(dá)35

10、.6％；流式細(xì)胞分析表明NCTD能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞表面整合素αvβ6的表達(dá),但對(duì)αvβ、αvβ5的表達(dá)無明顯影響,進(jìn)一步Western blotting分析顯示,僅有β6亞基蛋白含量明顯降低,αv、β3、β5亞基蛋白含量未見明顯變化；MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)αvβ6功能性阻抗10D5能夠增強(qiáng)NCTD抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng),整合素αvβ3、αvβ5的單克隆抗體LM609和F1P6無明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力；Western blotting分

11、析證實(shí),HT-29細(xì)胞經(jīng)NCTD處理后僅有磷酸化-ERK含量隨NCTD濃度增加或作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低,細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK、p-JNK(磷酸化-JNK)、P38和p-P38(磷酸化-ERK)水平無明顯變化；ERK抑制劑PD98059能明顯抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng),而JNK抑制劑(SP600125)和P38抑制劑(SB203580)則無此抑制效應(yīng)；免疫共沉淀證實(shí)NCTD干擾αvβ6-ERK直接連接的形成。
　　 結(jié)論：

12、r>　　 NCTD通過降低HT-29細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ6,阻礙了ERK的磷酸化過程,從而干擾αvβ6-ERK直接連接形成,阻斷了αvβ6介導(dǎo)的惡性生物學(xué)信號(hào)向胞內(nèi)的傳導(dǎo),最終達(dá)到誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
　　 意義：
　　 揭示了NCTD誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的具體機(jī)制,進(jìn)一步證實(shí)了整合素αvβ6及αvβ6-ERK直接連接在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用,為今后針對(duì)αvβ6

13、或αvβ6-ERK直接連接開展靶向治療提供了確切的理論依據(jù)。
　　 第二部分整合素αvβ6在結(jié)腸癌干細(xì)胞向高侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞分化中的作用研究
　　 目的：
　　 闡明整合素αvβ6的表達(dá)與結(jié)腸癌干細(xì)胞的相關(guān)性,并探索其在調(diào)控結(jié)腸癌干細(xì)胞向高侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞分化過程中的作用。
　　 方法
　　 免疫組化分析整合素αvβ6和結(jié)腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD133在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)相關(guān)性；流式細(xì)胞分析

14、HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)CD133陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù),并利用CD133分子的單克隆抗體ANC9C5分選CD133+HT-29細(xì)胞。將分選后的CD133+結(jié)腸癌細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中孵育,并觀察結(jié)腸癌干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。利用siRNA技術(shù)干擾CD133+結(jié)腸癌細(xì)胞中β6基因的表達(dá)后,進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)觀察αvβ6的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響,明膠酶譜分析檢測(cè)αvβ6的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞分泌MMP-9的影響。
　　 結(jié)果
　　

15、免疫組化染色證實(shí),結(jié)腸癌組織中整合素αvβ6和CD133的表達(dá)具有明顯的一致性。其陽性表達(dá)率大致相等,并均在腫瘤邊緣高表達(dá),中心低表達(dá)。對(duì)細(xì)胞行流式分析證實(shí),HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中CD133陽性表達(dá)率為1.6％,利用抗CD133分子的單克隆抗體ANC9C5分選HT-29細(xì)胞后,富集的CD133+HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞達(dá)92.6％。將分選后的CD133+HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中孵育,細(xì)胞在72小時(shí)后能形成明顯的腫瘤細(xì)胞球,呈現(xiàn)

16、出典型的干細(xì)胞特征。在無血清培養(yǎng)基中加入胎牛血清后,腫瘤細(xì)胞球逐漸消失,瘤細(xì)胞再次貼壁生長(zhǎng),符合已分化腫瘤細(xì)胞特征。構(gòu)建表達(dá)anti-β6 shRNA的質(zhì)粒,并將其導(dǎo)入CD133+HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞后,行RT-PCR和Western Blotting分析證實(shí),αvβp6 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯減低。MTT檢測(cè)證實(shí)αvβ6+CD133+HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中能正常分裂增殖,而αvβ6-CD133+HT-29細(xì)胞則幾乎無

17、增殖。明膠酶譜分析也證實(shí)αvβ6+CD133+HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞分泌MMP-9水平明顯高于αvβ6-CD133+HT-29細(xì)胞。
　　 結(jié)論
　　 整合素αvβ6和CD133分子在結(jié)腸癌腫瘤組織中共表達(dá)、共定位。整合素αvβ6能夠促進(jìn)CD133+的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng),并誘導(dǎo)其分泌MMP-9,在調(diào)控結(jié)腸癌干細(xì)胞向高侵襲結(jié)腸癌分化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　 意義
　　 揭示了整合素αvβ6調(diào)控結(jié)腸癌