ARHI在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景：結(jié)腸癌是多見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生的概率在國內(nèi)外均呈上升傾向，在男女性中發(fā)病和死亡的概率均居于各轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的第三位。早期不易發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的臨床癥狀及體征，超過一半的病人在確診結(jié)腸癌時已經(jīng)伴隨肺臟或者其它器官的轉(zhuǎn)移，確診時常已發(fā)生轉(zhuǎn)移，而15%以上的病人伴隨著肝臟轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌病死率高，按5年統(tǒng)計，早期生存率約92%，而晚期患者卻只有16%，所以使得結(jié)腸癌治療的難度加大，而且預(yù)后差。盡管目前國內(nèi)外研究在診斷和治療結(jié)腸癌方面有較大的研

2、究和進(jìn)步，但目前在胃腸道研究方面早期診斷結(jié)腸癌的方法仍然很局限。腫瘤的產(chǎn)生、生長與多種調(diào)控基因的活性息息相關(guān)。而參與其中的調(diào)控基因與蛋白的表達(dá)失調(diào)和細(xì)胞克隆增殖、遷移、侵襲、周期及凋亡緊密相關(guān)。抑癌基因ARHI（Aplysia Ras Homolog I，DIRAS3, NOEY2）可以參與相關(guān)周期及凋亡調(diào)節(jié)通路，通過影響通路下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，而發(fā)揮生物學(xué)活性。其作用可以使正調(diào)控周期蛋白如 cyclinD1表達(dá)明顯下降，從而影響周期發(fā)

3、展而抑制其無限繁殖。同時可以影響經(jīng)典的凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2和Bax等，增加凋亡率而達(dá)到抑癌作用。本實驗研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的基因 ARHI成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入結(jié)腸癌CaCo2和SW480細(xì)胞株中。通過觀察轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，深入探討 ARHI基因的生物學(xué)活性。檢測在轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)，研究 ARHI起作用的方式和信號通路，期待為結(jié)腸癌基因?qū)用娴闹委熖峁┯杏玫陌悬c，為早期診斷及治療提供理論憑據(jù)。
　　目

4、的：通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用重組質(zhì)粒將ARHI轉(zhuǎn)染入選中的實驗細(xì)胞，挑選出與對照組表達(dá)有明顯差異的結(jié)腸癌細(xì)胞株，構(gòu)建出高表達(dá)ARHI基因的穩(wěn)定株。研究ARHI基因?qū)Y(jié)腸癌CaCo2和SW480細(xì)胞株凋亡、周期、增殖、克隆形成、侵襲及遷移等影響。經(jīng)過測試相關(guān)蛋白在通路中表達(dá)，探索 ARHI參與發(fā)揮功能的可能機(jī)制及可能參與的傳導(dǎo)通路。為深入研究ARHI在結(jié)腸癌的產(chǎn)生、生長及臨床基因?qū)用娴闹委煿┙o相關(guān)的理論依據(jù)。
　　方法：⑴委托上海吉凱

5、基因生物有限公司構(gòu)建針對目標(biāo)基因 ARHI構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別為pcDNA3.1-flag和pcDNA3.1-flag–ARHI重組質(zhì)粒。經(jīng)過挑選四種不一樣的結(jié)腸癌細(xì)胞系，選出兩種滿意的為對象細(xì)胞系轉(zhuǎn)染，構(gòu)建出兩種 ARHI基因高表達(dá)的細(xì)胞株。每種細(xì)胞株分為目標(biāo)基因pcDNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)染組（ARHI）、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag空質(zhì)粒組（vector）。⑵采取RT-PCR技術(shù)檢驗ARHI基因在結(jié)腸惡性腫瘤細(xì)胞與其正常

6、粘膜組織中的差異性表達(dá)，從而篩選出低或不表達(dá) ARHI基因的結(jié)腸惡性腫瘤細(xì)胞。⑶采用RT-PCR和Western blot技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染后的ARHI mRNA。⑷采用Western blot方法測試轉(zhuǎn)染后ARHI基因蛋白及通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。⑸利用單克隆形成及 CCK8實驗檢查目的組和空質(zhì)粒對照組中細(xì)胞的增殖能力。⑹利用流式細(xì)胞技術(shù)測試ARHI組和Vector組細(xì)胞的周期和凋亡。⑺利用Transwell實驗測試細(xì)胞在ARHI組及Vecto

7、r組中的侵襲和遷移情況。⑻利用統(tǒng)計學(xué)SPSS19.0軟件對以上實驗中所得的數(shù)據(jù)予統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：①ARHI基因在正常粘膜組織中高表達(dá)，但在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)為表達(dá)較低甚至不表達(dá)。我們選擇CaCo2和SW480兩株細(xì)胞用于本實驗。②將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag和pcDNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌CaCo2和SW480細(xì)胞中，從而獲得高表達(dá)ARHI兩種細(xì)胞。③CCK8和克隆形成實驗結(jié)果表示：高表達(dá) ARHI

8、能抑制細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞技術(shù)測驗兩組細(xì)胞的凋亡，結(jié)果提示：pcDNA3.1-flag-ARHI組中細(xì)胞凋亡較 pcDNA3.1-flag組明顯增多；流式細(xì)胞技術(shù)測驗兩組細(xì)胞的周期，提示：pcDNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)染組中處于G0/G1期的細(xì)胞明顯多于對照組；Transwell遷移及侵襲實驗結(jié)果提示：pcDNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲及遷移能力均弱于pcDNA3.1-flag空載體組。④重組質(zhì)粒ARHI組中p-A

9、KT的表達(dá)較空質(zhì)粒組中表達(dá)降低，而p53和GSK-3β均在重組質(zhì)粒ARHI組中高表達(dá)，ARHI目的組中cyclin D1的表達(dá)比空白對照組中低，且將細(xì)胞周期停滯在G1期。負(fù)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2低表達(dá)，而凋亡正調(diào)控相關(guān)蛋白Bax表達(dá)相對升高。而AKT在兩個組中均無明顯表達(dá)差異。
　　結(jié)論：證實了ARHI的表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞株和其正常粘膜組織中存在明顯不一致，且于后者中高表達(dá)，而于前者中表達(dá)較低或不表達(dá)。根據(jù)此結(jié)論猜測，ARHI或

10、許參與了結(jié)腸癌的產(chǎn)生和生長，并主要扮演攔阻角色。于是構(gòu)建了ARHI高表達(dá)的CaCo2及SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株。實驗證實ARHI過表達(dá)可以阻止周期生長，并將其攔阻于G0/G1期，從而阻礙細(xì)胞的克隆及增殖能力；經(jīng)過影響凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2以及Bax促進(jìn)結(jié)腸惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡；同時降低其侵襲及遷移能力。我們結(jié)果得出ARHI可能通過抑制PI3K/AKT通路，促進(jìn)下游 GSK-3β的表達(dá)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了GSK-3β于cyclin D1的阻礙