整合素αυβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞生存和侵襲中的作用及相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 整合素屬于粘附分子家族，是一類陽離子依賴的跨膜糖蛋白受體，由α、β亞單位以非共價鍵結(jié)合組成。整合素介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)，以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，通過細(xì)胞外基質(zhì)信號傳導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖、轉(zhuǎn)移和分化。 整合素α vβ6是由α、β亞單位以非共價鍵結(jié)合組成的跨膜異二聚體，是一類只表達(dá)于惡性上皮性腫瘤組織而在正常組織及良性組織無表達(dá)的特殊整合素亞型，目前研究發(fā)現(xiàn)α vβ6在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)

2、揮重要作用，對其研究已成為熱點(diǎn)，并可為惡性腫瘤的診治提供廣闊的應(yīng)用前景。 在胚胎發(fā)育過程中以及上皮源性腫瘤及多種腫瘤細(xì)胞系，可見整合素α vβ6高表達(dá)。在成年組織炎癥和損傷修復(fù)過程中，α vβ6可促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、遷移至損傷部位，幫助上皮的重建。在腺上皮來源消化道腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)度以胰腺癌最高，其次為胃癌、結(jié)直腸癌、膽管癌、肝癌：鱗狀上皮來源腫瘤如肺癌、口腔鱗狀上皮癌亦可見其表達(dá)。 我們課題組對α vβ6與結(jié)腸癌之間的關(guān)系

3、進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究：發(fā)現(xiàn)不同類型結(jié)腸癌細(xì)胞表面具有不同數(shù)量的α vβ6表達(dá)，且與腫瘤惡性程度密切相關(guān)；利用α vβ6-cDNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，在體內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力顯著提高，動物實(shí)驗(yàn)中成瘤率、瘤體質(zhì)量、體積等較未轉(zhuǎn)染組均有顯著增加，并且通過β6胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不同部位刪除后轉(zhuǎn)染技術(shù)證實(shí)β6獨(dú)有的C末端11個氨基酸是控制其惡性行為的關(guān)鍵部位；我們對α vβ6與信號通路之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究，通過免疫共沉淀

4、、免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)α vβ6與ERK之間存在直接連接；腫瘤細(xì)胞通過α vβ6-MAPK/ERK信號通路調(diào)控MMP-9分泌，隨著整合素α vβ6的表達(dá)增多MAPK活性增加并伴隨MMP-9分泌增多，加速破壞降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)刪除β6胞內(nèi)段ERK結(jié)合位點(diǎn)（746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，下劃線表示兩者結(jié)合位點(diǎn)）可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長；我們的研究亦發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中α vβ6可促進(jìn)細(xì)

5、胞增殖，隨著腫瘤細(xì)胞密度增加伴有PKC活性增強(qiáng)，細(xì)胞可通過PKC途徑調(diào)控新生更多的α vβ6，α vβ6可通過PKC途徑誘導(dǎo)MMP-9的分泌增多，降解胞外基質(zhì)加速細(xì)胞擴(kuò)增，如此交叉循環(huán)促進(jìn)腫瘤的生長；我們利用反義寡核苷酸技術(shù)沉默α vβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和Widr的表達(dá)，顯著抑制MAPK活性，以及伴有細(xì)胞增殖侵襲能力的降低，在動物實(shí)驗(yàn)中可達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。 在最近組織學(xué)的研究中，Richard C.Bates等發(fā)現(xiàn)，

6、在結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）模型中可誘導(dǎo)α vβ6表達(dá)，組織芯片-免疫組織化學(xué)證實(shí)488例結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)率為37％，在淋巴結(jié)及肝癌轉(zhuǎn)移標(biāo)本中均檢測到α vβ6的表達(dá)，α vβ6與中位生存時間密切相關(guān)，可作為結(jié)腸癌預(yù)后指標(biāo)。我們利用組織芯片-免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測300例胃癌組織標(biāo)本α vβ6的表達(dá)并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其陽性表達(dá)率為36.7％，并且與腫瘤病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，Ka

7、plan-Meier曲線分析α vβ6陽性表達(dá)患者生存期限明顯縮短，可作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)檢測358例原發(fā)結(jié)腸癌組織α vβ6陽性表達(dá)率（34.0％）明顯低于63例結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組織的表達(dá)率（71.4％），提示α vβ6陽性表達(dá)患者較陰性表達(dá)著更具有肝臟轉(zhuǎn)移能力，該研究為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移提供了新的理論支持，提示α vβ6在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用。 綜上所述，α vβ6作為一種重要的細(xì)胞粘附分子受體，在胃

8、腸道惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其具體的作用機(jī)制目前已成為研究熱點(diǎn)。本研究是在既往國內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討α vβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞生長侵襲中的作用及相關(guān)的分子機(jī)制，隨著研究的不斷深入，必將為特異性靶向抗腫瘤藥物的研制開發(fā)和惡性腫瘤的生物治療提供廣闊的應(yīng)用前景。 第一部分：整合素α vβ6通過MAPK信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和胞外基質(zhì)降解 研究目的： 探討整合素α vβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的

9、作用及調(diào)控胞外基質(zhì)（ECM）降解的相關(guān)分子機(jī)制。 研究方法： 1.利用pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector質(zhì)粒構(gòu)建α vβ6特異性shRNA表達(dá)載體和對照組表達(dá)載體。α vβ6特異性shRNA表達(dá)載體以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT2972小時，用RT-PCR，yestern blotting實(shí)驗(yàn)分別檢測α vβ6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平； 2.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基

10、因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29體外侵襲能力的影響； 3.Western blot實(shí)驗(yàn)檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞ERK1/2，phospho-ERK1/2（P-ERK）表達(dá)的影響； 4.Western blot實(shí)驗(yàn)檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞uPA表達(dá)的影響； 5.明膠酶譜法檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞MMP-2，MMP-9表達(dá)的影響； 6.[3H]標(biāo)記的

11、Ⅳ型膠原降解分析實(shí)驗(yàn)檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞胞外基質(zhì)降解能力的影響以及MAPK信號通路與uPA、MMP-2、MMP-9在胞外基質(zhì)降解中的作用。 結(jié)果： 1.特異性shRNA表達(dá)載體可有效抑制HT29細(xì)胞中α vβ6的mRNA和蛋白表達(dá)； 2.RNA干擾介導(dǎo)抑制α vβ6表達(dá)顯著抑制HT29細(xì)胞的體外侵襲能力； 3.RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞ERK1/2的表達(dá)，更

12、重要的是抑制了其活性形式即磷酸化ERK1/2（phospho-ERK1/2，P-ERK）的表達(dá)； 4.RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞uPA，pro-MMP-9和pro-MMP-2的分泌； 5.RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默可顯著抑制胞外基質(zhì)的降解，且α vβ6介導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解是通過MAPK信號通路調(diào)控uPA、MMP-2、MMP-9分泌實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)論： 整合素α vβ6特異性shRNA表

13、達(dá)載體，可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞α vβ6的表達(dá)；沉默α vβ6表達(dá)可顯著抑制uPA、MMP-9、MMP-2以及ERK1/2介導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解；α vβ6通過MAPK信號通路調(diào)控uPA、MMP-9和MMP-2的分泌及活性，從而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用（見示意圖）。 意義： 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)一步揭示出α vβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)分子機(jī)制；進(jìn)一步從細(xì)胞及分子水平上解釋了前期組織學(xué)研究