AKR1B10在結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞生長中的作用及機(jī)制.pdf

1、醛酮還原酶家族1成員B10(AKR1B10,也叫醛糖還原酶相似蛋白1,ARL-1)主要在正常人結(jié)腸和小腸表達(dá),而在肝癌和肺癌中過度表達(dá)。AKR1B10能將有毒的醛酮類物質(zhì)還原成相應(yīng)的醇,具有解毒功能。并且AKR1B10還能通過與乙酰輔酶A羧化酶α(ACCA)形成蛋白復(fù)合物,阻止ACCA降解,從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成。ACCA在許多人類腫瘤中表達(dá)上調(diào),它可能通過刺激脂質(zhì)合成促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和增殖。AKR1B10在消化道的生物學(xué)作用,以及在腫瘤發(fā)展

2、、進(jìn)展中的作用還不清楚。本研究從分子生物學(xué)角度,初步探討了AKR1B10對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)和非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞(NCI-H460)的作用及相關(guān)機(jī)制。然后以非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞(NCI-H460和A549)為重點(diǎn),通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,進(jìn)一步研究了AKR1B10對(duì)非小細(xì)胞型肺癌生長的促進(jìn)作用及分子機(jī)制。這些研究為AKR1B10作為腫瘤的防治靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 由于AKR1B10調(diào)節(jié)ACCA的活性,在本研究中,我們首

3、先檢測(cè)了ACCA在結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8和HCT-15)和非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞(NCI-H460)中的表達(dá),以及應(yīng)用ACCA抑制劑(TOFA)和小干擾RNA(siRNA),觀察了ACCA在這些細(xì)胞生長存活中的作用。結(jié)果表明TOFA有顯著的細(xì)胞毒性作用,對(duì)NCI-H460、HCT-8和HCT-15細(xì)胞的半數(shù)抑制劑量分別是5.0、5.0和4.5μg/ml。TOFA在1.0-20.0μg/ml時(shí),呈劑量依賴性地有效地抑制了脂肪酸合成,誘導(dǎo)細(xì)胞凋

4、亡。通過檢測(cè)PARP分裂、DNA斷裂和annexin-Ⅴ染色這些凋亡指標(biāo)評(píng)估了細(xì)胞死亡。TOFA處理和siRNA轉(zhuǎn)染都同樣地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。補(bǔ)充細(xì)胞100μM棕櫚酸,脂肪酸合成末端產(chǎn)物,有效地阻止了TOFA和siRNA誘導(dǎo)的凋亡。
　　 接著,我們研究了AKR1B10沉默對(duì)細(xì)胞生長和存活的作用。結(jié)果在HCT-8和NCI-H460細(xì)胞中,小干擾RNA介導(dǎo)的AKR1B10表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了caspase-3介導(dǎo)的凋亡。在這些細(xì)胞中,總的

5、和亞類細(xì)胞脂質(zhì),尤其是磷脂減少了50％多,伴隨反應(yīng)性氧化物質(zhì)(ROS)增加了2到3倍,線粒體細(xì)胞色素C流出和caspase-3斷裂。AKR1B10沉默也增加了α,β-未飽和醛酮物,導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物增加2到3倍。補(bǔ)充細(xì)胞80μM棕櫚酸(脂肪酸合成的末端產(chǎn)物)后,部分地阻斷了AKR1B10沉默誘導(dǎo)的凋亡。而AKR1B10抑制劑epalrestat也使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物升高2倍多,并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明AKR1B10通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝

6、和消除細(xì)胞醛酮類物質(zhì)影響細(xì)胞存活。
　　 對(duì)肺癌的研究被擴(kuò)展到評(píng)估AKR1B10作為肺癌防治靶點(diǎn)的潛力,我們使用siRNA使.AKR1B10表達(dá)下調(diào),評(píng)估了非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞和腫瘤的生長。結(jié)果表明在NCI-H460和.A549細(xì)胞中,AKR1B10沉默阻止了細(xì)胞生長,并且減少了細(xì)胞液體培養(yǎng)基中和半固體培養(yǎng)基中的克隆形成率達(dá)40％多。組蛋白H2AX的磷酸化(DNA損傷的一個(gè)標(biāo)志)和彗星實(shí)驗(yàn)(alkaline comet assay

7、s)結(jié)果表明在AKR1B10沉默的細(xì)胞中,DNA損傷幾乎是對(duì)照組細(xì)胞的3倍。增加的基因毒性應(yīng)激也導(dǎo)致了p53活化和抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)減少,即Bax/bcl-2的比率增加,同時(shí)也激活了caspase-3介導(dǎo)的PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)斷裂和細(xì)胞凋亡。更重要的是,在裸鼠腫瘤移植實(shí)驗(yàn)中,AKR1B10表達(dá)下降明顯地延遲了皮下肺移植腫瘤的形成和進(jìn)展。在NCI-H460肺癌動(dòng)物模型中,當(dāng)AKR1B10的

8、表達(dá)被沉默后,腫瘤直到細(xì)胞注射后第17天才慢慢出現(xiàn),而對(duì)照組裸鼠的腫瘤在第9天就開始出現(xiàn)；并且對(duì)照組裸鼠腫瘤的生長速度將近是AKR1B10沉默組的2倍。同時(shí),在A549細(xì)胞的腫瘤動(dòng)物模型中,我們也觀察到了相似的結(jié)果。
　　 為更深入地研究AKR1B10在肺癌形成、進(jìn)展和防治中的作用,我們應(yīng)用四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)(BLOCK-iTTM InducibleH1 RNAi Entry Vector Kit,Invitogen)

9、建立了四環(huán)素調(diào)控AKR1B10表達(dá)的細(xì)胞模型。首先轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)TetR表達(dá)的重組質(zhì)粒(pcDNA6/TR)到NCI-H460細(xì)胞中,用10μg/ml blasticidin篩選得到穩(wěn)定克隆。再用PCR、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)得到高表達(dá)TetR的陽性克隆。然后再轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)AKR1B10 siRNA表達(dá)的重組質(zhì)粒(pENTRH1/TO/siRNA)到這些表達(dá)TetR的細(xì)胞克隆中。用400μg/mlzeocin篩選得到的穩(wěn)定克隆又經(jīng)過3μg/ml強(qiáng)力

10、霉素(Doxycycline,四環(huán)素類)誘導(dǎo)檢測(cè),從而得到AKR1B10表達(dá)受四環(huán)素調(diào)節(jié)的細(xì)胞克隆,擴(kuò)增凍存這些細(xì)胞以后備用。
　　 這些研究結(jié)果表明:AKR1B10既通過代謝醛酮類物質(zhì)而調(diào)節(jié)它在細(xì)胞內(nèi)的水平,又通過影響脂質(zhì)合成、線粒體功能和氧化狀況,在結(jié)腸癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞生長中起了重要作用。AKR1B10也影響了動(dòng)物腫瘤模型中肺癌的形成和進(jìn)展。這些結(jié)果為靶向AKR1B10的肺癌治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。這個(gè)研究也建立了