結(jié)腸癌及缺氧的結(jié)腸癌細(xì)胞中HIF-1α與miRNA-200b表達(dá)的相關(guān)性.pdf

1、目的:
　　結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見的高危害消化系惡性腫瘤，它具有以下臨床特點(diǎn):早期發(fā)病隱襲，并且無特殊的臨床不適表現(xiàn)，早期患者可有高達(dá)90％以上的5年生存率，然而大多數(shù)患者去醫(yī)院就診時(shí)，檢查到結(jié)腸癌已經(jīng)為進(jìn)展期，5年生存率只有65％左右，手術(shù)及放化療后對(duì)其預(yù)后改善不肯定，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移其致死的主要原因，因此探求結(jié)直腸癌高危個(gè)體的早期識(shí)別、早期診斷、早期治療顯得尤其重要。研究證明低氧是實(shí)體腫瘤組織內(nèi)部普遍存在的現(xiàn)象，且腫瘤細(xì)胞的缺氧可能是

2、惡性腫瘤進(jìn)展的啟動(dòng)因子之一，低氧使癌細(xì)胞更具轉(zhuǎn)移性、侵襲性，而EMT（epithelial mesenchymal transition，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）決定并參與了多種腫瘤上皮細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，因此在腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮著核心的作用。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變是這樣的一個(gè)過程:原發(fā)灶中靜止的腫瘤上皮細(xì)胞表型發(fā)生改變，失去細(xì)胞與細(xì)胞的黏著狀態(tài)，向具有運(yùn)動(dòng)遷移傾向的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，從而賦予了腫瘤上皮細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)移并且遠(yuǎn)處侵襲的能力。近年研究表明

3、EMT的發(fā)生與腫瘤所處的微環(huán)境密切相關(guān)，缺氧是結(jié)直腸癌最重要的微環(huán)境特點(diǎn)之一，HIF-1α是缺氧反應(yīng)最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。相關(guān)研究表明HIF-1α在腫瘤早期便有異常表達(dá)，不僅如此HIF-1α的異常表達(dá)和患者的術(shù)后生存率有關(guān)。所以，HIF-1α能夠作為有效的腫瘤篩查和預(yù)后標(biāo)記物，并且能夠在決定腫瘤的發(fā)生以及進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外，我們通過對(duì)腫瘤基因中非編碼小RNA的了解，發(fā)現(xiàn)它也參與了EMT相關(guān)進(jìn)程，不僅如此，非編碼小RNA在EMT

4、不同進(jìn)程中起到了重要的作用。MicroRNA-200家族已經(jīng)作為一類典型的抑癌基因被廣泛關(guān)注。其特點(diǎn)是在惡性腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，能夠作為EMT進(jìn)程、腫瘤細(xì)胞粘附、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制物。最近的報(bào)道稱:miR-200b能夠直接抑制VEGFR（vascular endothelial growthfactor receptor，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體）和VEGF（vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮

5、生長(zhǎng)因子相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤內(nèi)微小血管的生成，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲以及轉(zhuǎn)移過程產(chǎn)生影響。此外，腫瘤血管生成的另外一個(gè)關(guān)鍵原癌基因是轉(zhuǎn)錄因子Ets-1同樣受miR-200b的負(fù)性調(diào)控，而在低氧環(huán)中miR-200b表達(dá)顯著下調(diào)，從而促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的血管生成過程。前期已經(jīng)在結(jié)腸癌組織中證實(shí)MicroRNA-200家族在癌組織表達(dá)明顯低于正常組織，而大量文獻(xiàn)表明HIF-1α在癌組織中異常高表達(dá)。關(guān)于MicroRNA-200家族調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及靶

6、蛋白的研究有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但其本身在轉(zhuǎn)錄水平如何被調(diào)控缺乏深入研究。因此檢測(cè)了結(jié)直腸癌和癌旁組織中HIF-1α和miR-200b的表達(dá)，并且檢測(cè)不同缺氧條件下結(jié)直腸癌細(xì)胞中HIF-1α和mi-200b的表達(dá)來探討結(jié)腸癌中HIF-1α和miR-200b之間的聯(lián)系，為確立HIF-1α-miR-200b腫瘤調(diào)節(jié)通路提供依據(jù)。
　　方法:
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)50例結(jié)腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織中HIF-1α與miRNA-2

7、00b的表達(dá)。利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。利用CoCl2構(gòu)建結(jié)腸癌細(xì)胞系的缺氧誘導(dǎo)模型，通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別測(cè)定缺氧的Caco-2細(xì)胞中HIF-1α和miRNA-200b基因表達(dá)并確立兩者相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　在癌癥組織中HIF-1αmRNA的表達(dá)量明顯高于癌旁組織中其基因的表達(dá)量，而miRNA-200b基因的表達(dá)量與正好相反，其在癌旁組織中的表達(dá)明顯高于癌組織中的表達(dá)。通過對(duì)細(xì)胞

8、模擬缺氧處理后發(fā)現(xiàn):缺氧2h的HIF-1α蛋白水平升高，而后隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)HIF-1α蛋白表達(dá)緩慢下降(2～12)h，最后HIF-1α在16h表達(dá)量最高，miRNA-200b在缺氧2h的cαco-2細(xì)胞中表達(dá)量最低，2～12小時(shí)表達(dá)逐漸上升，16h的表達(dá)量下降至2h水平。Reαl-time PCR和Western blot聯(lián)合檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和miRNA-200b表達(dá)呈相反的趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　在結(jié)直腸癌組織HI