整合素ανβ與ERk-ETS1信號(hào)通路在調(diào)控結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 整合素αvβ6對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　目的：
　　研究整合素αvβ6對(duì)MMPs在mRNA和蛋白水平上表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.將HT-29或者WiDr細(xì)胞系分別分成三組:野生組(wild-type)、干擾β6組(Antisenceβ6)、對(duì)照組(control or mock)。將SW480細(xì)胞系分成三組:SW480野生型(wild type)

2、、空白質(zhì)粒對(duì)照組(mock transfected)以及β6轉(zhuǎn)染組(β6 transfected)。通過流式細(xì)胞技術(shù)以及western blot兩種方法分別進(jìn)行檢測(cè)整合素αvβ6的表達(dá)情況，以檢驗(yàn)我們的干擾效果，為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　2.利用quantitative Real-time PCR技術(shù)，對(duì)前述的各組結(jié)腸癌細(xì)胞中的有關(guān)MMPs的表達(dá)進(jìn)行mRNA水平的檢測(cè)。
　　3.對(duì)相關(guān)的MMPs的表達(dá)情況采用ELISA方法

3、進(jìn)行蛋白水平檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中，流式細(xì)胞技術(shù)以及western blot兩種方法均顯示SW480野生型(wild type)、空白質(zhì)粒對(duì)照組(mock transfected)不表達(dá)整合素β6，β6轉(zhuǎn)染組(β6 transfected)中的β6表達(dá)明顯升高。另外，在各組細(xì)胞中整合素αv亞基表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　2.在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29與WiDr中，干擾β6表達(dá)后，流式細(xì)胞技術(shù)以及w

4、esternblot兩種方法均顯示:與野生型(wild type)和空白質(zhì)粒對(duì)照組(mocktransfected)相比，β6干擾組(β6 Antisence)β6表達(dá)明顯降低。此外，各組細(xì)胞的整合素αv亞基表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　3.Real-time PCR結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29與WiDr中，相比較野生型(wild type)和空白質(zhì)粒對(duì)照組（mock transfected），我們發(fā)現(xiàn)β6干擾組(β6antisens

5、e)中MMP-2、MMP-3以及MMP-9的mRNA表達(dá)顯著降低，而其他幾種MMPs，包括MMP-1、MMP-7以及MMP-13，在干擾β6后表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分旨在研究整合素αvβ6對(duì)MMPs在mRNA和蛋白水平上表達(dá)的影響，首先通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等手段在結(jié)腸癌細(xì)胞系（包括SW480、HT29以及WiDr）過表達(dá)或者干擾整合素中β6的表達(dá)，并進(jìn)一步通過流式細(xì)胞技術(shù)以及western blot兩種方法分別

6、進(jìn)行檢驗(yàn)我們的干擾效果，為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。接下來(lái)通過quantitative Real-time PCR技術(shù)和ELISA方法來(lái)檢測(cè)整合素αvβ6對(duì)MMPs在mRNA和蛋白水平上表達(dá)的影響。本部分結(jié)果顯示，整合素αvβ6可以促進(jìn)MMP-2、MMP-3以及MMP-9的表達(dá)，對(duì)整合素αvβ6的理論知識(shí)進(jìn)一步豐富，并為下一步研究整合素αvβ6促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。
　　第二部分 轉(zhuǎn)錄因子ETS1介導(dǎo)整合素αvβ6調(diào)控M

7、MPs機(jī)制研究
　　目的：
　　研究轉(zhuǎn)錄因子ETS1對(duì)αvβ6調(diào)控MMPs的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞分組同第一部分。
　　2.采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中αvβ6的表達(dá)以及ETS家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ETS1、ETS2以及ELK1的表達(dá)。
　　3.采用熒光素酶報(bào)告基因(Luciferase)檢測(cè)方法，檢測(cè)整合素αvβ6誘導(dǎo)MMP-3和MMP-9基因表達(dá)過程中

8、是否涉及轉(zhuǎn)錄因子ETS1。
　　結(jié)果：
　　1.Real time-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29與WiDr中，干擾β6的表達(dá)后，ETS1、ETS2以及ELK1的總的mRNA和蛋白表達(dá)量無(wú)明顯改變，而ETS1的活化形式一磷酸化ETS1(p-ETS1)表達(dá)量明顯下降，磷酸化ETS2(p-ETS2)和磷酸化ELK1(p-ELK1)仍然沒有變化。
　　2.在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中，過表達(dá)β

9、6之后，相較于野生型SW480和mockSW480，磷酸化ETS1(p-ETS1)明顯升高，磷酸化ETS2(p-ETS2)和磷酸化ELK1(p-ELK1)未見明顯改變
　　3.Luciferase結(jié)果顯示，將ETS1 siRNA轉(zhuǎn)入HT29與WiDr細(xì)胞系中，MMP-3和MMP-9的啟動(dòng)子活性有明顯降低，而MMP-2的活性無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分實(shí)驗(yàn)揭示，結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29與WiDr中，整合素αvβ

10、6均可有效的促進(jìn)ETS1的活化，在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，過表達(dá)β6之后亦可促進(jìn)ETS1的磷酸化。同時(shí)，ETS1可以提高M(jìn)MP-3和MMP-9啟動(dòng)子的活性，ERK/MAPK信號(hào)通路，整合素αvβ6質(zhì)膜穿梭和整合素αvβ6-ERK2直接連接在轉(zhuǎn)錄因子ETS1介導(dǎo)整合素αvβ6調(diào)控MMPs機(jī)制研究過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。本部分研究明確了整合素αvβ6在基因轉(zhuǎn)錄層面上調(diào)控MMPs表達(dá)的具體機(jī)制，為下一步研究整合素αvβ6促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移

11、機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。
　　第三部分 整合素αvβ6通過ERK-ETS1通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：
　　研究整合素αvβ6促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　方法：
　　1.在HT29與WiDr細(xì)胞系中，加入PD98059，primaquine或者ETS1 siRNA之后，Real-time PCR和ELISA檢測(cè)MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達(dá)變化。
　　2.

12、在已經(jīng)穩(wěn)定干擾β6表達(dá)的HT29與WiDr中轉(zhuǎn)入pcDNA-ETS1質(zhì)粒，Real-timePCR和ELISA檢測(cè)其MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達(dá)變化。3.在過表達(dá)β6的SW480中，加入PD98059，primaquine，或者ETS1 siRNA之后，Real-time PCR和ELISA檢測(cè)MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達(dá)變化。
　　4.在HT29細(xì)胞中，給予整合素β6抗體10D5對(duì)整合素β

13、6進(jìn)行阻斷，使用PD98059抑制ERK活化，或者采用ETS1 siRNA抑制ETS1表達(dá)，采用Transwell侵襲小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT29的侵襲和遷移能力變化。
　　5.將SW480細(xì)胞分為三組:轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(mock transfectant)，轉(zhuǎn)染β6組(β6 transfectant)，以及轉(zhuǎn)染含有β6突變基因質(zhì)粒組(SW480 Mutantβ6transfectant)，在各組細(xì)胞中，加入10D5阻斷整合素β6

14、，給予抑制劑PD98059抑制ERK活化或者給予ETS1 siRNA抑制ETS1表達(dá)之后，采用Transwell侵襲小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲和遷移能力變化。
　　結(jié)果：
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示在HT29與WiDr細(xì)胞系中，加入PD98059，primaquine或者ETS1 siRNA之后，MMP-3/MMP-9在mRNA表達(dá)量明顯下降。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示MMP-3/MMP-9在蛋白水平上表

15、達(dá)同樣明顯降低。
　　2.在已經(jīng)穩(wěn)定干擾β6表達(dá)的HT29與WiDr中轉(zhuǎn)入pcDNA-ETS1質(zhì)粒，Real-timePCR和ELISA結(jié)果顯示，在mRNA和蛋白水平上，干擾β6所引起的下降的MMP-3/MMP-9，在過表達(dá)ETS1之后均再次上升。
　　3.在過表達(dá)β6的SW480中，Real-time PCR和ELISA結(jié)果顯示，因過表達(dá)β6而表達(dá)增加的MMP-3/MMP-9，在加入PD98059，primaquine，或

16、者ETS1siRNA之后再次降低。
　　4.在HT29細(xì)胞中，與未作任何處理的野生型HT29細(xì)胞相比，給予整合素β6抗體10D5對(duì)整合素β6進(jìn)行阻斷，使用PD98059抑制ERK活化，或者采用ETS1 siRNA抑制ETS1表達(dá)均可明顯減弱HT29的侵襲或者遷移能力。
　　5.在轉(zhuǎn)染β6的SW480中組中，加入10D5阻斷整合素β6，給予抑制劑PD98059抑制ERK活化或者給予ETS1 siRNA抑制ETS1表達(dá)，Tran

17、swell侵襲小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的侵襲或者遷移能力明顯下降，相對(duì)而言，加入IgG2a并未影響細(xì)胞的侵襲能力，而在SW480 mock transfectant和Mutantβ6transfectant組中，細(xì)胞的侵襲和遷移能力沒有降低。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分實(shí)驗(yàn)揭示，整合素αvβ6通過ERK-ETS1通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，并與整合素αvβ6質(zhì)膜穿梭和整合素αvβ6-ERK2直接連接密不可分。本部分研