整合素ανβ6在胃癌及結(jié)腸癌中的研究.pdf

1、研究背景：整合素αvβ6作為一種只在發(fā)生惡性病變的上皮組織中表達(dá)的粘附因子，目前在結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌以及口咽部癌中的研究已經(jīng)取得了重要的成果，尤其是在結(jié)腸癌方面的研究，更加深入細(xì)致；并且證實(shí)，αvβ6在上述惡性腫瘤中對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移方面起到重要的促進(jìn)作用。但是在胃癌中關(guān)于整合素αvβ6的研究，目前尚未見報(bào)道。胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后很差；目前在我國(guó)，其發(fā)病率及死亡率居全部惡性腫瘤之首；在世界上居癌癥死亡原因的

2、第二位；而結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率亦居高不下。因此，尋找一種有效地治療胃癌和結(jié)腸癌的手段，已成為醫(yī)學(xué)工作者迫在眉睫的任務(wù)。既然整合素αvβ6在結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌以及口咽部癌中具有重要的促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用，那么是否在胃癌中也具有類似的作用?是否可以成為治療胃癌和結(jié)腸癌的一種有效的針對(duì)目標(biāo)呢?我們的課題就是基于這樣的背景和目的而展開的研究。 第一部分整合素αvβ6對(duì)胃癌細(xì)胞增殖浸潤(rùn)的作用 目的：研究整合素αvβ6在胃癌細(xì)胞

3、的生存、增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中所起的作用。 方法：先應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)篩選表達(dá)整合素αvβ6的胃癌細(xì)胞AGS進(jìn)行培養(yǎng)；構(gòu)建針對(duì)αvβ6的小片段干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，然后應(yīng)用RT-PCR及Western Blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)整合素αvβ6的表達(dá)被抑制的效果。對(duì)照組細(xì)胞采用只加脂質(zhì)體2000的細(xì)胞和陰性siRNA(negative-siRNA)轉(zhuǎn)染的

4、細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前后，采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；粘附分析檢測(cè)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力變化；酶譜法檢測(cè)細(xì)胞分泌MMP-9的變化；Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化；裸鼠皮下種植細(xì)胞，觀察其成瘤能力的變化。通過(guò)比較試驗(yàn)組和對(duì)照組之間的各試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差別，分析整合素αvβ6所起的作用。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，應(yīng)用RT-PCR及Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AGS細(xì)胞內(nèi)整合素αvβ6的表達(dá)在mRNA水平及蛋

5、白水平均被明顯抑制；抑制了整合素αvβ6的表達(dá)后，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖力僅為對(duì)照組細(xì)胞的49.3％(P＜0.01)；粘附分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的粘附力僅為對(duì)照組細(xì)胞的79％(P＜0.01)；酶譜分析見細(xì)胞分泌MMP-9的能力為對(duì)照組細(xì)胞的18.3％(P＜0.01)；侵襲試驗(yàn)見細(xì)胞的侵襲力為對(duì)照組細(xì)胞的28％(P＜0.01)；成瘤試驗(yàn)見試驗(yàn)組細(xì)胞形成肉眼可見的腫瘤的時(shí)間約為種植后13天，而對(duì)照組細(xì)胞為6天；種植后6周，試驗(yàn)組細(xì)胞形成腫瘤的平均體

6、積約為820mm3，而對(duì)照組細(xì)胞約為160mm3(P＜0.01)。 結(jié)論：整合素αvβ6對(duì)胃癌細(xì)胞AGS的增殖、粘附、侵襲能力起著重要的促進(jìn)作用，抑制了αvβ6的表達(dá)，就可以抑制AGS細(xì)胞的增殖和侵襲。 意義：揭示了整合素αvβ6在胃癌細(xì)胞增殖侵襲及轉(zhuǎn)移中的重要作用，豐富了整合素αvβ6的理論知識(shí)，并為靶向治療胃癌的研究提供了確切的理論依據(jù)。 第二部分整合素αvβ6在胃及結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中的作用 目的：研究

7、整合素αvβ6對(duì)胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。 方法：應(yīng)用針對(duì)整合素αvβ6的siRNA抑制胃癌AGS細(xì)胞中αvβ6的表達(dá)，而用針對(duì)αvβ6的單克隆抗體10D5封閉結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中αvβ6的功能后，用Hoechst熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)及凋亡率的變化；應(yīng)用caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性的變化；應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax，F(xiàn)as，F(xiàn)as-li

8、gand等的變化，以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的分布和磷酸化ERK，JNK，p38(P-ERK，P-JNK，P-p38)等的變化。 結(jié)果：抑制了整合素αvβ6的表達(dá)(AGS)，或者封閉了αvβ6的功能后(HT29)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮、碎裂、熒光染色明顯增強(qiáng)，并出現(xiàn)典型的凋亡小體。細(xì)胞凋亡率明顯增高，與對(duì)照組細(xì)胞相比較，P＜0.01。easpase-3活性檢測(cè)證實(shí)，兩種細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性均

9、明顯增強(qiáng)；Western Blotting結(jié)果顯示，抑制了αvβ6的表達(dá)后，AGS細(xì)胞內(nèi)Fas，F(xiàn)as-ligand的表達(dá)增高；Bax表達(dá)增高，而Bc1-2的表達(dá)降低；細(xì)胞色素C由線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)中；細(xì)胞內(nèi)P-ERK表達(dá)降低，P-p38表達(dá)增高；分別與對(duì)照組相比較，P＜0.01；而P-JNK無(wú)明顯變化(P＞0.05)。而在HT29細(xì)胞中，應(yīng)用10D5封閉了αvβ6的功能后，HT29細(xì)胞中Bc1-2的表達(dá)降低，Bax表達(dá)增高(P＜0.0

10、1)，而Fas和FasL的表達(dá)均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。細(xì)胞色素C由線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)中；細(xì)胞內(nèi)P-ERK表達(dá)降低(P＜0.01)，而P-p38和P-JNK均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 結(jié)論：整合素αvβ6在胃癌細(xì)胞AGS和結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中都起著重要的抑制凋亡的作用，抑制了αvβ6的表達(dá)或者封閉了αvβ6的功能，細(xì)胞的凋亡率都會(huì)明顯增高；在AGS細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，死亡受體途徑和線粒體途徑均參與其中，而在HT29細(xì)胞的凋

11、亡過(guò)程中，僅有線粒體途徑參與；另外，MAPK途徑在此凋亡過(guò)程中，發(fā)揮了重要作用；P-ERK在AGS和HT29細(xì)胞中均具有抑制凋亡的作用，而P-p38僅在AGS細(xì)胞中發(fā)揮了促進(jìn)凋亡的進(jìn)程。 意義：揭示了整合素αvβ6在抑制胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中的重要作用及其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制，豐富了整合素αvβ6的理論知識(shí)，并為靶向治療胃癌及結(jié)腸癌的研究提供了確切的理論依據(jù)。 第三部分整合素αvβ6在胃癌預(yù)后中的作用 目的：研究整合素

12、αvβ6在胃癌組織中的表達(dá)情況，以及αvβ6對(duì)胃癌預(yù)后的影響。 方法：選擇300例胃癌病人的手術(shù)病理標(biāo)本，制作組織芯片，并行整合素αvβ6的免疫組化染色；回顧性分析這些病人的臨床病例資料，結(jié)合免疫組化結(jié)果，分析整合素αvβ6在胃癌組織中的表達(dá)與其臨床病理資料之間的關(guān)系；并通過(guò)生存分析，判斷其對(duì)胃癌病人預(yù)后的影響。 結(jié)果：整合素αvβ6在胃癌組織中的整體表達(dá)率約為36.7％；其表達(dá)與病人的年齡、性別以及腫瘤的大小無(wú)明顯關(guān)系

13、，而與腫瘤的Lauren分型、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、以及TNM分期相關(guān)。整合素αvβ6表達(dá)陽(yáng)性的病人，其生存時(shí)間較αvβ6表達(dá)陰性的病人明顯縮短；且此關(guān)系在早期或晚期腫瘤病人中均存在，特別是在早期胃癌病人中更加明顯。 結(jié)論：整合素αvβ6對(duì)胃癌病人的生存是一種重要的危險(xiǎn)因素。意義揭示了整合素αvβ6在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與各臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系，并首次證實(shí)了整合素αvβ6在胃癌預(yù)后中的重要作用，豐富了整合