整合素αvβ6在胃癌AGS細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 探討整合素αvβ6在胃癌AGS細(xì)胞增殖、凋亡和化療耐藥等惡性生物學(xué)行為中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法
　　 實(shí)驗(yàn)分兩部分。
　　 第一部分,培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分3組處理。對(duì)照組:不做特殊處理；10D5組:收集細(xì)胞重懸于RPMI1640中,向細(xì)胞懸液加入αvβ6單克隆抗體10D5,使其終濃度為0.1mg/mL,冰浴30min使其充分作用后置培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h,PBS清洗終止反應(yīng)；IgG2a組

2、:用10D5陰性對(duì)照劑鼠IgG2a以相同濃度處理,方法同10D5組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blotting檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)情況以研究整合素αvβ6在胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。
　　 第二部分,培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分4組處理。對(duì)照組:細(xì)胞貼壁后(6h)換液,加入含特定濃度5-FU的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；10D5組:向細(xì)胞懸液加入10D5,使其終濃度為0.1mg/mL,冰

3、浴30min使其充分作用后置培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h,換液加入含特定濃度5-FU的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；IgG2a組:加入10D5對(duì)照劑IgG2a后用5-FU處理,試劑濃度和方法同10D5組:PD98059組:細(xì)胞貼壁后(6h)換液,加入含5-FU和終濃度為20μmol/LPD98059的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blotting檢測(cè)Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)情況以研究αvβ6是否可

4、介導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞對(duì)5-FU的耐受及β6-ERK直接通路在其中的作用。其中,MTT選取5-FU濃度為0.5mmol/L,流式和Western blotting選取5-FU濃度為0.2mmol/L。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 第一部分:
　　 1.經(jīng)MTT法檢測(cè),用10D5封閉αvβ6后,細(xì)胞的存活率下降至(73.74±1.7)％(P<0.05),而

5、IgG2a處理組(99.4±2.9)％與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>O.05)。
　　 2.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞并用WinMD12.9軟件分析得出,對(duì)照組、10D5組、IgG2a組的凋亡率分別為(1.93±0.09)％、(11.82±0.45)％、(2.06±0.04)％。10D5組細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組相比明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IgG2a組和對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3.經(jīng)半

6、定量光密度分析,caspase-3表達(dá)水平組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,10D5組表達(dá)水平大于對(duì)照組P(0.05)。IgG2a組與對(duì)照組相比,caspase-3表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 第二部分,
　　 1.5-FU毒性檢測(cè):用含5-FU濃度為0.005、0.05、0.5、5mmol/L的培養(yǎng)基孵育24小時(shí)后,胃癌AGS細(xì)胞抑制率分別為(17.31±0.78)％、(19.55±0.64)％、(47.56±3.

7、23)％、(80.87±3.4)％。
　　 2.經(jīng)MTT法檢測(cè),對(duì)照組、10D5組、IgG2a組、PD98059組的抑制率分別為(28.11±2.7)％、(84.49±1.6)％、(31.44±5.2)％、(86.72±5.2)％。10D5組、PD98059組的抑制率均明顯大于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IgG2a組和對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 3.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞并用WinMD1

8、2.9軟件分析得出,對(duì)照組、10D5組、IgG2a組、PD98059組的凋亡率分別為(6.63±1.4)％、(30.55±2.4)％、(8.13±1.3)％、(35.99±4.0)％。10D5組、PD98059組的凋亡率與對(duì)照組相比均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IgG2a組和對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 4.經(jīng)半定量光密度分析,10D5組、PD98059組的caspase-3表達(dá)水平均大于對(duì)照組(

9、P<0.05),而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平小于后者(P<0.05)；IgG2a組與對(duì)照組相比,caspase-3和Bcl-2表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論及意義
　　 1.胃癌AGS細(xì)胞表面的αvβ6被特異性抗體封閉后,細(xì)胞增殖減慢,凋亡增加,caspase-3表達(dá)水平上調(diào)。表明αvβ6在AGS細(xì)胞增殖和抗凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　 2.胃癌AGS細(xì)胞表面的αvβ6被特異性抗體封閉后冉用5-FU誘導(dǎo)

10、細(xì)胞凋亡,與對(duì)照組及鼠IgG2a組相比,細(xì)胞的增殖減慢,凋亡增加,caspase-3表達(dá)水平上調(diào)而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平下調(diào)。表明αvβ6可通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)抑制5-FU誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)5-FU耐受的產(chǎn)生。
　　 3.用PD98059阻斷ERK功能后,胃癌AGS細(xì)胞的增殖減慢,凋亡增加,caspase-3的表達(dá)水平上調(diào)而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平下調(diào),表明PD98059消除了αvβ6介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU的