MYCT1在Wnt信號通路及結腸癌發(fā)生中的作用研究.pdf

1、Wnt信號通路在胚胎發(fā)育、細胞增殖和分化過程中和腫瘤發(fā)生中起到極其重要的作用。研究表明:大約90％的腸道癌癥是由于Wnt信號通路的異常激活引起的,另外有80％的結腸癌是因為APC基因的突變導致Wnt信號通路的異常激活而導致的
　　 MYCT1(myc target1)基因最初發(fā)現(xiàn)于喉癌細胞中,后因發(fā)現(xiàn)其啟動子上有兩個E-box即c-MYC結合位點,故命名為myc target1。孫開來等人研究發(fā)現(xiàn)MYCT1的表達量在喉癌、肝癌等

2、癌癥組織中低于相應癌旁組織。MYCT1過表達還能抑制癌細胞的生長,國內研究人員將MYCT1定義為一種抑癌基因。國外研究人員對鼠源的MYCT1蛋白進行研究發(fā)現(xiàn),MYCT1蛋白在許多方面能起到替代MYC蛋白的作用。其功能之強大得到了眾多科學家的肯定。
　　 在本研究課題中,我們利用攜帶有MYCT1 shRNA的非復制型腺病毒對MYCT1在Wnt信號通路及結腸癌發(fā)生中的作用進行研究。研究結果表明,MYCT1蛋白能夠通過同β-calen

3、in和TCF-4相結合的方式調控Wnt信號通路,并且在SW480的裸鼠皮下結腸癌模型中的實驗中,MYCT1在結腸癌的發(fā)生及生長中起到了重要的作用。
　　 [實驗方法]
　　 本實驗室利甩Adeasy系統(tǒng)成功構建出攜帶有靶向MYCT1 mRNA的非復制型腺病毒,命名為ad-shMYCT1;另外構建一對應非復制型腺病毒ad-shGPF作為對照病毒。構建好的病毒經鑒定正確后,通過在HEK293細胞中擴增,并運用CsCl密度梯度

4、離心純化得到高低度的病毒。純化后的病毒運用TCID50法在HEK293中測出其滴度后方可用于實驗;運用Western blotting、RT-qPCR和luciferase reporter實驗檢測ad-shMYCT1對Wnt下游基因轉錄激活的影響;免疫共沉淀實驗被運用于檢測MYCT1蛋白相互作用的蛋白;運用裸鼠成瘤實驗和免疫組化實驗研究MYCT1在結腸癌發(fā)生及生長中的作用。
　　 [實驗結果]
　　 體外實驗結果表明,

5、ad-shMYCT1能夠下調Wnt下游基因的mRNA和蛋白表達水平,并能夠顯著抑制TCF-4轉錄調控的活性。免疫共沉淀實驗表明MYCT1可能依靠與β-Catenin和TCF-4相結合的方式參與Wnt信號通路的調節(jié)。體內實驗證明,ad-shMYCT1對SW480荷瘤具有良好的治療效果:實驗組裸鼠接受ad-shMYCT1治療后腫瘤生長受到明顯抑制,而注射了PBS或者ad-shGPF后對照組裸鼠腫瘤生長迅速;實驗組裸鼠的生存時間也明顯比對照組

6、裸鼠的要長。免疫組化實驗的結果也證明ad-shMYCT1能夠下調結腸癌標志物CD44的表達。
　　 [結論]
　　 本文通過在BJ5183感受態(tài)細菌中重組、HEK293細胞中包裝產生腺病毒的方法成功得到了不含野生型腺病毒污染的攜帶有MYCT1 shRNA和GFP shRNA的非復制型腺病毒。實驗結果表明:運用ad-shMYCT1下調MYCT1表達能夠顯著抑制Wnt信號通路的激活,并抑制結腸癌的生長。MYCT1能夠作為基因