MiR-608通過靶向調(diào)控MIF基因的表達(dá)影響GSCs的生物學(xué)行為.pdf

1、前言：
　　腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是最具侵襲性的顱內(nèi)腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類生命健康。目前臨床治療膠質(zhì)瘤常用的手段是外科手術(shù)切除瘤體后輔以術(shù)后放療。但由于膠質(zhì)瘤的周圍組織浸潤性生長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量無法從根本上得到改善，且膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后極差。而膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma Stem Cells，GSCs)的自我更新、多向分化等特點(diǎn)使得腦膠質(zhì)瘤容易復(fù)發(fā)，是影響腦膠質(zhì)瘤治療效果的關(guān)鍵因素。
　　MicroRNAs(

2、miRNAs)是一類單鏈非編碼RNAs，分子生物學(xué)研究水平的深入發(fā)展促進(jìn)越來越多的研究證實(shí)miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如在腫瘤的發(fā)生、血管生成、遷移、侵襲中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。有報(bào)道表明miR-608在結(jié)腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞性肺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，但其在膠質(zhì)瘤中的相關(guān)作用及機(jī)制尚未有明確報(bào)道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)miR-608在GSCs中呈低表達(dá)，推測(cè)miR-608可能在膠質(zhì)瘤中同樣發(fā)揮著抑癌基因的作用，但其發(fā)

3、揮作用的靶位點(diǎn)還需進(jìn)一步的探討。
　　巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)作為一種進(jìn)化上高度保守的多效性分子廣泛過表達(dá)于多種腫瘤組織細(xì)胞中如結(jié)腸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤等。MIF具有誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡的功能。MIF以及MIF受體CD44、CD74廣泛參與并調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示MIF在多種腫瘤組織細(xì)胞中表達(dá)水平較高，如乳

4、腺癌、肝癌、宮頸癌[1-3]。Michel等的研究發(fā)現(xiàn)MIF在腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，表明MIF在腦膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[4]。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MIF是miR-608的潛在結(jié)合位點(diǎn)。但MIF在GSCs中的相關(guān)作用及分子機(jī)制還未明確。
　　本研究通過改變miR-608與MIF基因的表達(dá)水平，分析GSCs生物學(xué)行為及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的活性，旨在探討miR-608與MIF在GSCs生物學(xué)行為中的調(diào)控作用

5、，明確其可能的分子作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及U251細(xì)胞，人胚腎細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞GSCs-U87及GSCs-U251的培養(yǎng)。
　　2、MIF基因過表達(dá)或表達(dá)沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建。
　　3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-608和MIF基因在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　4、Western blot分析腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中MIF蛋白的內(nèi)源性表達(dá)水平以及

6、改變miR-608表達(dá)水平后腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中MIF蛋白的表達(dá)水平。
　　5、雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-608和MIF的直接作用。
　　6、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)改變miR-608表達(dá)水平，同時(shí)改變miR-608和MIF基因表達(dá)水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖能力的影響。
　　7、遷移侵襲實(shí)驗(yàn)分析改變miR-608表達(dá)水平，同時(shí)改變miR-608和MIF基因表達(dá)水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。
　　8、流式細(xì)胞儀檢測(cè)改

7、變miR-608表達(dá)水平，同時(shí)改變miR-608和MIF基因表達(dá)水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞凋亡能力的影響。
　　9、Western blot檢測(cè)同時(shí)改變腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中miR-608和MIF基因的表達(dá)水平時(shí)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立MIF過表達(dá)和MIF沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　2、MiR-608在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下降，

8、MIF基因在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著上升。MiR-608過表達(dá)可抑制MIF蛋白的表達(dá)水平，miR-608沉默可促進(jìn)MIF蛋白的表達(dá)水平。
　　3、MIF是miR-608的靶基因。
　　4、MiR-608過表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。MiR-608沉默可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，抑制其細(xì)胞凋亡。
　　5、MiR-608過表達(dá)同時(shí)MIF沉默可抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、遷移、

9、侵襲，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。MiR-608沉默同時(shí)MIF過表達(dá)可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，抑制其細(xì)胞凋亡。
　　6、MiR-608過表達(dá)同時(shí)MIF沉默可顯著抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt及p-JNK蛋白活性。MiR-608沉默同時(shí)MIF過表達(dá)可顯著促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt及p-JNK蛋白活性。
　　討論：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-608在GSCs中低表達(dá)，通過改變GSCs中mi

10、R-608和MIF的表達(dá)水平，檢測(cè)其對(duì)GSCs生物學(xué)行為及PI3K/Akt、JNK信號(hào)通路活性的影響，明確了miR-608通過調(diào)控MIF基因的表達(dá)水平調(diào)控GSCs的生物學(xué)行為的可能機(jī)制。
　　本研究結(jié)果顯示miR-608在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中低表達(dá)，表明在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中miR-608可能發(fā)揮抑癌基因作用。進(jìn)一步的研究顯示上調(diào)miR-608的表達(dá)水平能抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，且促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。下調(diào)miR-608的表達(dá)水平則有相

11、反的結(jié)果。但是miR-608在GSCs中的具體作用機(jī)制尚未明確。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果表明miR-608與MIF有直接結(jié)合位點(diǎn)且MIF是miR-608的靶基因。表明在GSCs中miR-608通過下調(diào)MIF的表達(dá)水平發(fā)揮抑癌基因的作用。MIF作為促癌基因廣泛參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)進(jìn)程。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-608的同時(shí)沉默MIF的表達(dá)水平能顯著抑制GSCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)GSCs細(xì)胞凋亡。而沉默

12、miR-608的同時(shí)過表達(dá)MIF的表達(dá)水平則有與之相反的結(jié)果。從而雙向驗(yàn)證了miR-608通過下調(diào)MIF的表達(dá)水平來發(fā)揮抑癌基因的作用，但其中進(jìn)一步的作用機(jī)制尚不明確。許多研究表明MIF在腫瘤中的作用機(jī)制涉及到細(xì)胞信號(hào)通路的活化。在COS-7/M6細(xì)胞、人前列腺癌細(xì)胞、人滋養(yǎng)層細(xì)胞中，MIF可與CD44和CD74形成復(fù)合物從而激活ERKI/2信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示過表達(dá)miR-608的同時(shí)沉默MIF的表

13、達(dá)水平能顯著抑制GSCs細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-JNK/JNK的表達(dá)水平，而沉默miR-608的同時(shí)過表達(dá)MIF的表達(dá)水平則有與之相反的結(jié)果。表明miR-608通過下調(diào)MIF的表達(dá)水平抑制PI3K/Akt、JNK信號(hào)通路活性。
　　綜上所述，本研究首次揭示了miR-608對(duì)GSCs生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用。本研究證明miR-608通過下調(diào)MIF基因的表達(dá)水平，抑制PI3K/Akt和JNK通路活性，從而抑制

14、GSCs的增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此miR-608可能是腦膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　1、MiR-608在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平低于在非干細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　2、MIF是miR-608的靶基因，且miR-608在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控MIF基因的表達(dá)。
　　3、過表達(dá)miR-608通過靶向結(jié)合MIF并下調(diào)其表達(dá)水平，抑制PI3K/Akt及JNK信號(hào)通路活性，從而抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖