miR-21與PTEN靶向調(diào)控作用對(duì)腎母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的
　　腎母細(xì)胞瘤（Wilms' tumor，WT）是兒科最為常見的原發(fā)于腎臟的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，WT占所有兒科腫瘤的6％，其在小于15歲的兒童及青少年中綜合發(fā)病率約為0.1‰。WT平均診斷年齡為36個(gè)月，大于10歲或小于6月齡的病例較為少見。腎母細(xì)胞瘤的發(fā)病原因尚未完全了解，目前認(rèn)為，其可能起源于異常增生的、未正常分化形成腎單位的后腎胚基。腎母細(xì)胞瘤的組織學(xué)分類包括上皮型、胚芽型、間葉型及混合型四類;每一

2、類又可根據(jù)是否含有間變細(xì)胞而分為預(yù)后好的組織結(jié)構(gòu)（不含間變細(xì)胞，F(xiàn)H）及預(yù)后差的組織結(jié)構(gòu)（可檢出間變細(xì)胞，UH）。腎母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要包括:無癥狀腹部腫塊、血尿、腹痛、高血壓，及腫瘤壓迫癥狀等，并可伴發(fā)多種先天畸形，如WAGR綜合征、BWS綜合征、DDS綜合征等。
　　腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因的表達(dá)異常，是多因素、多階段及體內(nèi)外多種因素共同作用的復(fù)雜過程，并可能與遺傳因素有關(guān)。而惡性腫瘤發(fā)生和演進(jìn)過程中的一個(gè)重要特征

3、，就是癌基因的激活或過表達(dá)與抑癌基因的缺失或表達(dá)抑制。同時(shí)，腎母細(xì)胞瘤是公認(rèn)的應(yīng)用現(xiàn)代綜合療法效果最好的小兒惡性實(shí)體腫瘤之一，目前腎母細(xì)胞瘤的治療趨勢(shì)是，在盡量保持并不斷提高現(xiàn)有生存率的基礎(chǔ)上盡可能減少治療強(qiáng)度，以降低治療相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率，最終降低病死率。因此，明確的診斷和分期，確切的病理分型，個(gè)體化的綜合治療，尋找敏感的分子生物學(xué)指標(biāo)以指導(dǎo)治療和隨訪，是改善腎母細(xì)胞瘤患兒預(yù)后，提高生存率的重要手段。
　　微小RNA(micro

4、RNAs，miRNAs)是一類僅含18-25nt的，具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)功能的非編碼，單鏈短序列RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的作用幾乎貫穿整個(gè)生命活動(dòng)的全過程，其對(duì)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡等方面的作用正日益受到關(guān)注。眾多國內(nèi)外研究成果都證實(shí)，miRNA復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的紊亂與細(xì)胞增殖和凋亡過程的調(diào)節(jié)失控可能存在一定關(guān)聯(lián)，因此miRNA可作為癌基因或抑癌基因，參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)等關(guān)鍵階段。
　　作為miRNA中具

5、有代表性的癌基因之一，miR-21在幾乎所有研究過的實(shí)體腫瘤組織中均呈高表達(dá)，miR-21主要通過與多種抑癌基因mRNA的3'-UTR區(qū)不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，使其功能受到抑制，從而發(fā)揮癌基因的作用。目前多種成人腫瘤的研究已經(jīng)證實(shí)，miR-21的下游靶基因包括Maspin、PDCD4、PTEN、RECK、Sprouty（包括Spry-1、Spry-2）、TIMP-3、TPM1等，miR-21通過調(diào)控上述抑癌基因，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、

6、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。但其在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及作用機(jī)理尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
　　對(duì)于“明星”抑癌基因PTEN來說，其獨(dú)特的磷酸酶活性可通過多種途徑在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，拮抗癌基因的作用，維持機(jī)體的正常代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。國內(nèi)外大量研究表明，在包括腎母細(xì)胞瘤在內(nèi)的多種進(jìn)展期腫瘤中均可見PTEN的高頻突變或缺失，提示其低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)及惡性行為關(guān)系密切。
　　對(duì)于經(jīng)典的具有癌基因活性的PI3K/A

7、KT信號(hào)通路而言，其在多種研經(jīng)究證實(shí)的腫瘤細(xì)胞中異常激活，對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和侵襲、抑制凋亡，以及介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的化學(xué)耐藥和放療抵抗等機(jī)制中起著重要作用。而PTEN正是負(fù)向調(diào)控這一信號(hào)通路起始的關(guān)鍵酶之一，它可以通過一系列磷酸化作用顯著抑制AKT的活化，進(jìn)一步阻斷AKT調(diào)控的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)抗AKT作為癌基因的作用。
　　在多種成人腫瘤的研究中，都提示或證實(shí)PTEN是miR-21潛在靶基因之一。因此我們推測(cè)，在腎母細(xì)胞瘤中

8、，miR-21與PTEN也存在這種靶向調(diào)控關(guān)系，并通過這一靶向調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步調(diào)控腎母細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為。
　　基于以上理論，本研究的目的是:分析miR-21及PTEN蛋白在小兒腎母細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常對(duì)照組織中的表達(dá)差異，探討miR-21和PTEN蛋白的表達(dá)與小兒腎母細(xì)胞瘤包括性別、年齡、臨床分期、病理組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的多種臨床病理參數(shù)及WT患兒預(yù)后的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)腎母細(xì)胞瘤原代細(xì)胞，采用miR-21

9、inhibitor抑制miR-21的表達(dá)，觀察PTEN及下游PI3k/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)，研究PTEN活性的變化，并研究miR-21表達(dá)抑制對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲及細(xì)胞凋亡等在內(nèi)的生物學(xué)行為的影響，最終證實(shí)WT中兩者的靶向調(diào)控關(guān)系，深入探究miR-21與PTEN參與WT發(fā)生演進(jìn)的可能機(jī)制，以期為WT早期的分子生物學(xué)診斷及靶向治療的研究提供一定的理論支持和實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。
　　方法
　　1.miR-21及PT

10、EN在腎母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)、臨床意義及與預(yù)后的相關(guān)性研究:收集89例小兒腎母細(xì)胞瘤患者腫瘤組織及30例瘤旁正常腎組織，采用qRT-PCR和蛋白免疫印跡法分別檢測(cè)miR-21及PTEN基因和蛋白的表達(dá)水平在WT和瘤旁組織中的差異，探討miR-21和PTEN蛋白的表達(dá)與小兒腎母細(xì)胞瘤包括性別、年齡、臨床分期、病理組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的多種臨床病理參數(shù)及WT患兒預(yù)后的關(guān)系。兩組之間基因和蛋白表達(dá)的差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)水

11、平與腎母細(xì)胞瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系統(tǒng)計(jì)采用x2檢驗(yàn);生存分析方面，應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制并分析生存曲線，生存率的結(jié)果應(yīng)用log-rank進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行預(yù)后的單因素回歸分析;應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行預(yù)后的多因素回歸分析以探究影響WT患兒預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，設(shè)P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　2.miR-21在腎母細(xì)胞瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞中靶向調(diào)控PTEN機(jī)制的研究:采用細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)

12、染經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miR-21高表達(dá)的腎母細(xì)胞瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞，抑制原代細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，利用qRT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測(cè)原代細(xì)胞中miR-21、PTEN mRNA和蛋白水平的變化，并觀察其對(duì)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。隨后利用CCK-8、Transwell小室和流式細(xì)胞技術(shù)觀察抑制miR-21對(duì)WT原代細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的影響。最后，利用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)PTEN-3'-

13、UTR活性變化。各基因及相關(guān)蛋白表達(dá)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果
　　1.腎母細(xì)胞瘤組織中miR-21、PTEN的表達(dá)、臨床意義及與預(yù)后的相關(guān)性:與瘤旁對(duì)照組織相比，腎母細(xì)胞瘤組織中，(1) miR-21的表達(dá)顯著上調(diào)，而PTEN蛋白的表達(dá)顯著降低，二者表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2) miR-21表達(dá)上調(diào)與患兒年齡(

14、＞2y)、較高臨床分期、病理組織分型（UH型）及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素密切相關(guān)(P＜0.05);PTEN蛋白的下調(diào)與患幾年齡(＞2y)、較高臨床分期、病理組織分型（UH型）等臨床病理因素密切相關(guān)(P＜0.05);(3)直線相關(guān)分析表明，miR-21與PTEN蛋白的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性(r=-0.687，P＜0.05);(4)病例資料的2y及5y生存情況的單因素生存分析結(jié)果顯示，miR-21高表達(dá)和PTEN蛋白的低表達(dá)與WT患兒的不良預(yù)后

15、密切相關(guān)。多因素方差分析表明，盡管miR-21和PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量直接與多個(gè)臨床病理參數(shù)及患兒預(yù)后相關(guān)，但尚不能成為影響WT患兒預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　2.miR-21在腎母細(xì)胞瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞中靶向調(diào)控PTEN機(jī)制:在WT原代培養(yǎng)細(xì)胞中，(1)轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可明顯抑制miR-21的表達(dá);(2) miR-21抑制后，PTEN蛋白水平增加，而mRNA表達(dá)水平變化不明顯，證明miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平沉默PTE

16、N表達(dá);(3) miR-21抑制后，PTEN蛋白表達(dá)水平增加，其下游的PI3K、p-AKT等信號(hào)通路關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平均降低，證實(shí)miR-21通過抑制PTEN，從而正向調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用;(4)與陰性對(duì)照組(NC)和空白對(duì)照組(MOCK)比較，轉(zhuǎn)染抑制組(IN)下調(diào)miR-21對(duì)明顯抑制WT原代細(xì)胞的增殖和侵襲（P＜0.05），顯著增加WT原代培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡(P＜0.05);(5)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證

17、實(shí)，IN組能導(dǎo)致野生型PTEN-3'-UTR螢光活性的增加，而NC組不能導(dǎo)致野生型PTEN-3'-UTR螢光活性的增加(P=0.002)，證實(shí)PTEN在3'-UTR端受miR-21的直接調(diào)控;IN組中，野生型PTEN-3'-UTR螢光活性與突變型PTEN-3'-UTR相比顯著降低(P=0.002)，證實(shí)miR-21靶向調(diào)控PTEN的靶點(diǎn)位于突變位點(diǎn);IN組和NC組對(duì)突變型PTEN-3'-UTR的螢光活性均無影響(P=1.000)，證實(shí)P

18、TEN分子3'-UTR端的突變位點(diǎn)作為miR-21的靶位點(diǎn)具有唯一性。
　　結(jié)論
　　1.WT組織中，miR-21表達(dá)上調(diào)，PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)，兩分子的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，并與腎母細(xì)胞瘤的惡性程度、侵襲性及不良預(yù)后關(guān)系密切，因此miR-21與PTEN分子可作為評(píng)價(jià)WT惡性程度、預(yù)后及輔助制定放化療方案的有價(jià)值的分子標(biāo)志物;
　　2.WT原代培養(yǎng)細(xì)胞中，miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平靶向負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)，并通過PTEN正向