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文檔簡介
1、以腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)為代表的腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,由于其對放化療及生物免疫治療缺乏敏感,故成為腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等晚期病人預(yù)后差的關(guān)鍵因素。深入研究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理,并探尋合適的標(biāo)靶是當(dāng)前該病診斷、治療及預(yù)后的潛在方向。在腎透明細(xì)胞癌中,SETD2基因是僅次于 VHL和PBRM1的第三大抑癌基因,而有關(guān)它的表達(dá)缺失或下調(diào)機(jī)制,目前尚不明晰。微
2、小 RNA(miRNA)是一類短鏈非編碼 RNA,通過在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因,下調(diào)靶基因表達(dá)并影響其所在的信號通路傳導(dǎo),從而在生物體生命活動尤其是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中扮演重要角色。結(jié)合生物信息學(xué)及相關(guān)的預(yù)測軟件,我們發(fā)現(xiàn)miRNA與SETD2存在潛在的關(guān)聯(lián)性,即SETD2基因的表達(dá)缺失或下調(diào)可能源于某一或某些 miRNAs的負(fù)性調(diào)控。因此,本研究旨在從 miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面著手探索 SETD2表達(dá)缺失或下調(diào)的機(jī)制,以闡明 SE
3、TD2及相關(guān)miRNAs對ccRCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為未來的臨床診治提供理論依據(jù)。我們將通過檢測 SETD2基因及各預(yù)測候選 miRNAs在人 ccRCC中的表達(dá)水平,揭示它們在ccRCC臨床診斷與治療中的潛在意義;通過體外實驗,探索并驗證ccRCC中靶向調(diào)控SETD2的miRNAs;研究miRNA調(diào)控SETD2對ccRCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并探索其潛在的作用機(jī)制。本研究分為以下三個部分:
第一部分 SETD2基因及
4、各預(yù)測miRNAs在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)研究
目的:檢測人正常腎組織與腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)組織及細(xì)胞中SETD2基因、各預(yù)測miRNAs的表達(dá)差異,篩選與SETD2潛在關(guān)聯(lián)的miRNA(s)。
方法:采用實時定量PCR(qPCR)和western blot法分別檢測40例臨床組織標(biāo)本及細(xì)胞系中 SETD2基因的 mRNA水平和蛋白表達(dá)量,并分析其表達(dá)差異。隨機(jī)選取30例配對ccRCC組織與正常腎組織,采用免疫
5、組織化學(xué)染色法(IHC)檢測并分析 SETD2蛋白在正常腎與癌組織中的表達(dá)差異。應(yīng)用 Target-Scan、microRNA.org、miRWalk等多個靶點預(yù)測軟件逆向篩選可能靶向作用于SETD2基因的miRNAs,同時結(jié)合在線ccRCC的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫,篩選出可能調(diào)控SETD2的miRNAs。采用qPCR檢測各預(yù)測miRNAs在細(xì)胞系及組織標(biāo)本中的表達(dá)水平并比較其差異,同時分析各預(yù)測 miRNAs與 SETD2表達(dá)的相關(guān)性
6、。
結(jié)果:相較正常腎組織,SETD2基因的 mRNA在77.50%(31/40)的 ccRCC組織中顯著下調(diào),而 SETD2蛋白表達(dá)水平在65.00%(26/40)的 ccRCC組織中顯著下調(diào)。相較 HK-2細(xì)胞系,786-O和SN12-PM6細(xì)胞中的 SETD2基因mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示 SETD2蛋白在正常腎組織中76.67%(23/30)呈強(qiáng)陽性表達(dá),13.33%(4/30)呈弱陽性表
7、達(dá),10.00%(3/30)為低表達(dá);在 ccRCC組織中,80.00%(24/30)呈低表達(dá)或無表達(dá),16.67%(5/30)呈弱陽性表達(dá),3.33%(1/30)為強(qiáng)陽性表達(dá)。miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142–5p和miR-20a-5p被篩選作為可能調(diào)控 SETD2基因的候選 miRNAs。相較 HK-2細(xì)胞系,miR-23b-5p、miR-34b-3p、 miR-106b-5p和mi
8、R-142–5p在786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中均高表達(dá),而 miR-20a-5p表達(dá)差異不明顯。相較正常腎組織,miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、 miR-142–5p和miR-20a-5p在 ccRCC中顯著上調(diào)的比例分別為:60.00%(24/40)、55.00%(22/40)、67.50%(27/40)、47.50%(19/40)和35.00%(14/40)。經(jīng) t檢驗分析顯示在 ccRC
9、C組織與正常腎組織中表達(dá)有顯著差異的 miRNAs分別是:miR-23b-5p、miR-34b-3p、 miR-106b-5p和miR-142–5p。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在ccRCC組織中SETD2的mRNA水平與miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。
結(jié)論:在 ccRCC中,SETD2基因是一個重要的抑癌基因,其表達(dá)缺失或下調(diào)可能與候選 miRNAs:miR-23b-5p
10、、miR-34b-3p和miR-106b-5p的異常上調(diào)有關(guān)。
第二部分在腎透明細(xì)胞癌中miR-106b-5p靶向調(diào)控SETD2及其機(jī)制研究
目的:在miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平探索 SETD2基因在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)缺失或下調(diào)的機(jī)制。
方法:采用化學(xué)合成法獲得各預(yù)測 miRNAs的抑制劑 anti-miRNAs及模擬物mimics,分別將其轉(zhuǎn)入ccRCC細(xì)胞系786-O和SN12-PM6,應(yīng)用實時熒光定
11、量PCR及 western blot法檢測 SETD2基因 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。構(gòu)建含SETD2基因3’-UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報告載體,采用雙熒光素酶法進(jìn)行檢測分析以探索候選miRNAs對SETD2的調(diào)控方式。設(shè)計“逆轉(zhuǎn)”實驗,將小干擾 RNA si-SETD2與候選 miRNA的抑制劑共轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞系,應(yīng)用qPCR和western blot法分別檢測SETD2基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化,進(jìn)一步探索候選miRNA
12、對SETD2基因可能的調(diào)控作用。
結(jié)果:轉(zhuǎn)入各預(yù)測 miRNAs的抑制劑后,僅 anti-miR-106b-5p使786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中的 SETD2基因 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。而反過來,向786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-106b-5p的模擬物mimic后,SETD2基因的 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。雙熒光素酶檢測分析結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)入miR-106b-5p的模擬物mimic后,HK-2、7
13、86-O和SN12-PM6細(xì)胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性明顯降低,而3’-UTR突變型無顯著影響。相反,在轉(zhuǎn)入 miR-106b-5p的抑制劑后,786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中 SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性顯著提高,而3’-UTR突變型無明顯改變。另外,在“逆轉(zhuǎn)”實驗中,轉(zhuǎn)入 anti-miR-106b-5p可使786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)
14、,而同時轉(zhuǎn)入si-SETD2將逆轉(zhuǎn)anti-miR-106b-5p轉(zhuǎn)入所致的SETD2表達(dá)上調(diào)作用。
結(jié)論:SETD2基因是 miR-106b-5p的一個新的靶基因,在腎透明細(xì)胞癌中SETD2基因的表達(dá)缺失或下調(diào)可能是由于miR-106b-5p的過表達(dá)所致。
第三部分 miR-106b-5p調(diào)控SETD2對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究
目的:研究miR-106b-5p調(diào)控SETD2對腎透明細(xì)
15、胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在影響,并探索其作用機(jī)制。
方法:同前述“逆轉(zhuǎn)”實驗,將轉(zhuǎn)染分為5組,即 anti-NC+ si-NC、anti-miR-106b-5p+ si-NC、si-NC、si-SETD2和anti-miR-106b-5p+ si-SETD2,分別轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞系786-O與 SN12-PM6,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期和凋亡的可能變化,并采用EdU法檢測細(xì)胞增殖的改變。同時,我們采用qPCR與wester
16、n blot法分別檢測上述各組轉(zhuǎn)染情況下腎癌細(xì)胞中p53、caspase3的表達(dá)變化。同時提取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的核蛋白,western blot法檢測核蛋白 H3K36me3可能的表達(dá)變化。另外,通過雙熒光素酶實驗檢測 miR-106b-5p調(diào)控 si-SETD2對p53啟動子活性可能的影響,并應(yīng)用 ChIP技術(shù)探索 p53基因啟動子與H3K36me3的潛在關(guān)系。
結(jié)果:流式細(xì)胞周期、凋亡檢測及EdU細(xì)胞增殖實驗檢測結(jié)果顯示在78
17、6-O與SN12-PM6中,沉默 miR-106b-5p均可使兩種腎癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,即G0/G1比例增加,而S期減少,且細(xì)胞增殖明顯減少,細(xì)胞凋亡明顯增加,而干擾 SETD2表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展,即 G0/G1期減少,S期增多,且細(xì)胞增殖明顯增加,細(xì)胞凋亡明顯減少。此外,干擾 SETD2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默 miR-106b-5p所致的細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加和增殖抑制效應(yīng)。qPCR結(jié)果顯示在786-O與 SN12-P
18、M6細(xì)胞中,沉默 miR-106b-5p可使 p53基因mRNA明顯上調(diào),而干擾SETD2表達(dá)一方面使p53 mRNA明顯下調(diào),另一方面還可逆轉(zhuǎn)沉默 miR-106b-5p所致的 p53基因 mRNA上調(diào)效應(yīng)。各轉(zhuǎn)染組caspase-3基因的 mRNA變化無明顯改變。Western blot結(jié)果顯示在沉默 miR-106b-5p后,786-O與 SN12-PM6細(xì)胞中 p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase-3蛋白(cl
19、eaved caspase-3)的表達(dá)顯著增加,而前體 caspase-3蛋白(procaspase-3)明顯下調(diào);相較對照組,干擾 SETD2表達(dá)可使 p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase3蛋白(cleaved caspase-3)表達(dá)下調(diào),而前體caspase3蛋白(procaspase-3)增加;此外,干擾SETD2可逆轉(zhuǎn)沉默miR-106b-5p所致的 p53、H3K36me3、cleaved caspase-
20、3三種蛋白上調(diào)及 procaspase-3蛋白下調(diào)。ChIP實驗與雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示在786-O與SN12-PM6中,沉默miR-106b-5p可使 H3K36me3與 p53啟動子區(qū)的相對結(jié)合量顯著增加,p53啟動子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性也明顯增加;而干擾 SETD2表達(dá)則使H3K36me3與 p53啟動子區(qū)的相對結(jié)合量顯著減少,p53啟動子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性亦明顯減少;此外,干擾 SETD2也逆轉(zhuǎn)了沉默miR
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