miR-106b-5p和miR-17-5p調(diào)控成骨分化影響小鼠骨形成的機(jī)制研究.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重危害著人類健康，其特征是骨吸收和骨形成失衡引起的骨量減少。骨平衡主要取決于成骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨形成與破骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨吸收。間充質(zhì)干細(xì)胞是脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞的祖細(xì)胞，可以分化為成骨細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的減少是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要原因。許多研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)是影響成骨細(xì)胞分化的最重要因子。BMP-2是在成骨細(xì)胞的分化過程中的一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)分子，是TGF-β超家族的一員。Sm

2、ad5是下游轉(zhuǎn)錄因子，可以被BMP-2受體激活。磷酸化的Smad5與Smad4形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1/Runx2。BMP-2和Smad5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是成骨分化過程中的重要信號(hào)通路。MicroRNAs(miRNAs)是小的非編碼單鏈RNAs，總長(zhǎng)度在18-25個(gè)核苷酸。一般來說，miRNA能通過結(jié)合靶基因的3'非編碼區(qū)(3' UTRs)抑制其翻譯或促進(jìn)其mRNA降解，從而抑制靶基因。miRNA在許多生物過程

3、中都是必不可少的，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生。大量研究表明，miRNAs在成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用。例如，miR-133和mir-135通過影響骨形成的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制骨分化，包括Runx2和Smad5。研究表明，miR-214和miR-145可以通過靶向Osterix，抑制成骨細(xì)胞的分化。mir-302a通過抑制COUP-TFII促進(jìn)成骨細(xì)胞分化miR-338-3P被證實(shí)通過靶向Runx2和FGFR2抑制

4、成骨分化。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-135可以靶向結(jié)合Smad5抑制成骨分化。然而，對(duì)于調(diào)節(jié)Smad5表達(dá)的miRNAs仍需要我們進(jìn)一步的研究。
　　方法：⑴在成骨分化的過程中，miR-106b-5p和miR-17-5p的表達(dá)量顯著下調(diào)。我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，首先檢測(cè)了mir-106b-5p和miR-17-5p在成骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)。采用C2C12和MC3T3-E1細(xì)胞作為細(xì)胞模型。為了誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成骨分化，培養(yǎng)

5、基用無血清DMEM和300 ng/ml BMP-2取代正常培養(yǎng)基。為了誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨分化，培養(yǎng)基用無血清α-MEM和300 ng/mlBMP-2取代正常培養(yǎng)基。然后我們檢測(cè)了與成骨分化密切相關(guān)的表型標(biāo)記物的表達(dá)，包括Runx2、ALP和OC。⑵miR-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨分化。我們還檢測(cè)了mir-106b-5p和miR-17-5p相應(yīng)的模擬物和抑制劑對(duì)成骨分化的影響。將mir-106b-5p和mi

6、R-17-5p模擬物/抑制劑和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNAs模擬物/抑制劑的干擾效率和Runx2、ALP和OC的表達(dá)。我們用western-blot法檢查Runx2蛋白的表達(dá)，用堿性磷酸酶染色和茜素紅染色檢測(cè)C2C12細(xì)胞的成骨分化。⑶miR-106b-5p和miR-17-5p靶向結(jié)合Smad5。我們通過生物信息學(xué)軟件Targetscan6.2和microRNA.org預(yù)測(cè)miR-106b-5p和

7、miR-17-5p的靶基因。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Smad5作為mir-106b-5p和miR-17-5p的靶基因。因此，我們進(jìn)行了熒光素酶活性驗(yàn)證，共轉(zhuǎn)染野生型小鼠3' UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(WT)和突變型質(zhì)粒(MUT)與mir-106b-5p和miR-17-5p模擬物/抑制劑，轉(zhuǎn)到C2C12和MC3T3-E1細(xì)胞中，檢測(cè)熒光素酶活性得改變。為了驗(yàn)證miR-106b-5p和miR-17-5p靶向結(jié)合于Smad5，我們將miR-106b-5

8、p和miR-17-5p轉(zhuǎn)染到小鼠C2C12細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)Smad5蛋白的表達(dá)。⑷miR-106b-5p和miR-17-5p通過靶向結(jié)合Smad5抑制成骨分化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證mir-106b-5p和miR-17-5p通過靶向結(jié)合Smad5抑制成骨細(xì)胞分化。我們用Smad5特異性的siRNA抑制其表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)siRNA的抑制作用。并且將siSmad5和mir-106b-5p和m

9、iR-17-5p的inhibitors共同轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，qRT-PCR檢測(cè)成骨分化基因的表達(dá)。⑸mir-106b-5p和miR-17-5p能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)骨形成。為了探索在體內(nèi)miR-106b-5p和miR-17-5p的作用，建立了卵巢切除的小鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，我們將化學(xué)修飾的特異性mir-106b-5p和miR-17-5p（antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p）(80mg/kg)以及陰性對(duì)照、PB

10、S注射到小鼠體內(nèi)。當(dāng)連續(xù)注射3天antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p后，qRT-PCR檢測(cè)骨組織中mir-106b-5p和miR-17-5p水平。為了保持mir-106b-5p和miR-17-5p的水平，這些小鼠在第一次注射后第四周的1到3天連續(xù)注射antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p以及陰性對(duì)照、PBS。干預(yù)6周后處死所有小鼠，進(jìn)行分析。采用雙能X線骨密度儀(DXA)測(cè)定骨密

11、度。我們用顯微CT分析骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)和骨小梁數(shù)目(TB.n)，骨小梁厚度(TB.Th)，骨小梁間距(TB.SP)。我們用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物如Runx2、ALP、OC和Smad5以及小鼠血清B-ALP。
　　結(jié)果：①在成骨分化的過程中，miR-106b-5p和miR-17-5p的表達(dá)量顯著下調(diào)。用BMP-2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞和MC33-E1細(xì)胞成骨分化后，我們發(fā)現(xiàn)成骨分化基因Runx2、ALP和OC的m

12、RNA水平明顯上調(diào)。上述結(jié)果表明，我們已經(jīng)成功地誘導(dǎo)成骨分化。與此同時(shí)，與對(duì)照組相比，BMP-2誘導(dǎo)組mir-106b-5p和miR-17-5p的表達(dá)量顯著下調(diào)。我們的研究表明，miR-106b-5p和miR-17-5p可能對(duì)成骨分化起到重要的調(diào)控作用。②miR-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨分化。miR-106b-5p和miR-17-5p模擬物/抑制劑和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞后48 h，我們驗(yàn)證了miRNA模擬物/

13、抑制劑的干擾效率。轉(zhuǎn)染mir-106b-5p和miR-17-5p抑制劑到C2C12細(xì)胞中，24 h無血清培養(yǎng)后，我們用qRT-PCR檢測(cè)Runx2、ALP和OC的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。相反，C2C12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mir-106b-5p和miR-17-5p模擬物，結(jié)果顯示成骨分化基因mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)。同樣，C2C12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-106b-5p和miR-17-5p抑制劑后Runx2蛋白表達(dá)顯著增加，轉(zhuǎn)染其模

14、擬物后Runx2蛋白表達(dá)顯著下降。在誘導(dǎo)分化7d后，與對(duì)照組相比，ALP染色結(jié)果顯示在mir-106b-5p和miR-17-5p模擬物組的藍(lán)色明顯變淺，而mir-106b-5p和miR-17-5p抑制劑組的藍(lán)色則明顯深。在誘導(dǎo)分化14d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，基質(zhì)礦化水平得到相似的結(jié)果。我們的數(shù)據(jù)表明，mir-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨細(xì)胞分化。③miR-106b-5p和miR-17-5p靶向結(jié)合Smad5。mir-1

15、06b-5p、miR-17-5p和Smad5質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到C2C12和MC3T3-E1兩個(gè)細(xì)胞系中，Smad5野生型組(WT)顯示出明顯抑制熒光素酶活性，而突變組(Mut)沒有顯示出熒光素酶活性的改變。我們發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞中過表達(dá)miR-106b-5p和miR-17-5p，會(huì)明顯抑制Smad5蛋白水平，而mir-106b-5p和miR-17-5p抑制組， Smad5蛋白表達(dá)增加。這些數(shù)據(jù)表明，mir-106b-5p和miR-17-5

16、p可能抑制基因Smad5的表達(dá)。④miR-106b-5p和miR-17-5p通過靶向結(jié)合Smad5抑制成骨分化。跟預(yù)期結(jié)果相同，轉(zhuǎn)染siRNA到C2C12細(xì)胞中顯示出Smad5的表達(dá)量明顯下降，表明siSmad5干擾Smad5表達(dá)成功。然后我們分別將miR-106b-5p和miR-17-5p的抑制劑及siSmad5轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)siSmad5可以將mir-106b-5p和miR-17-5p抑制成骨分化的作用明顯逆轉(zhuǎn)。我們的

17、數(shù)據(jù)表明，mir-106b-5p和miR-17-5p靶向結(jié)合Smad5基因，從而抑制C2C12細(xì)胞成骨分化。⑤mir-106b-5p和miR-17-5p能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)骨形成。當(dāng)在小鼠體內(nèi)注射連續(xù)antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p3天后，qRT-PCR顯示骨組織中mir-106b-5p和miR-17-5p的表達(dá)量明顯下降。相反，antagomir NC和PBS組中mir-106b-5p和miR-17-5p表達(dá)

18、量沒有發(fā)生改變。這些數(shù)據(jù)表明，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p能有效抑制骨組織中mir-106b-5p和miR-17-5p表達(dá)。骨密度測(cè)量結(jié)果表明，在假手術(shù)組，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p干預(yù)的小鼠股骨表現(xiàn)出明顯的骨密度(BMD)增加。去卵巢組的小鼠表現(xiàn)出股骨骨密度的降低。antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p干預(yù)去卵巢小鼠組具有最小的骨

19、密度。microCT數(shù)據(jù)的定量分析顯示，無論在假手術(shù)組還是在去卵巢組，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p治療組的小鼠骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(TB.n)和骨小梁厚度(TB.Th)顯著上調(diào)，骨小梁間距(TB.SP)變小。這些數(shù)據(jù)表明，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p參與骨代謝的調(diào)節(jié)。骨組織的檢測(cè)結(jié)果顯示，antagomir-106b-5p和antagomir-1

20、7-5p干預(yù)小鼠，能增加成骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物如Runx2、ALP、OC在骨組織中的表達(dá)。與此同時(shí)，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p干預(yù)組也增加Smad5（靶基因）在骨組織中的表達(dá)水平;同樣，血清中ALP水平也升高。這些結(jié)果表明antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p可通過促進(jìn)骨形成增加骨量。
　　結(jié)論：⑴在成骨分化的過程中，miR-106b-5p和miR-17-5p的表達(dá)

21、量顯著下調(diào)。⑵miR-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨分化。⑶miR-106b-5p和miR-17-5p靶向結(jié)合Smad5。⑷miR-106b-5p和miR-17-5p通過靶向結(jié)合Smad5抑制成骨分化。⑸mir-106b-5p和miR-17-5p能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)骨形成。我們的結(jié)果表明，mir-106b-5p和miR-17-5p可能通過靶向結(jié)合Smad5基因抑制成骨分化和抑制體內(nèi)骨形成。這揭示了miRNA對(duì)成骨分化和骨形成新的作