miR-135a-5p與miR-199a-5p在心肌肥大中的作用及初步機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥大是高血壓、肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)和其它心血管疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥,是心肌重構(gòu)的典型特征,可引起心力衰竭,最終導(dǎo)致死亡。右心肥大常見(jiàn)于PAH,肺血管重構(gòu)和阻力增加是其重要原因;左心肥大常見(jiàn)于高血壓等疾病。心肌肥大已成為心血管疾病發(fā)病率和死亡率升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,引起人們的廣泛關(guān)注。目前心肌肥大的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,臨床缺乏有效的治療心肌肥大的藥物,提示需要尋找其他新的致病

2、機(jī)制。因此,深入研究其發(fā)病機(jī)制并尋找新的防治心肌肥大的分子靶標(biāo)具有重要意義。
　　microRNAs(miRNAs)是一段22~25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA,它通過(guò)與下游靶基因的3’非編碼區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合,屬轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),參與細(xì)胞的生長(zhǎng)。已有研究提示一些miRNAs在心肌肥大形成后表達(dá)異常,但miRNAs在心肌肥大形成過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律及作用機(jī)制少見(jiàn)報(bào)道。有學(xué)者通過(guò)生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)并報(bào)道了數(shù)種與心肌肥大發(fā)生相關(guān)的miRNAs

3、,我們?cè)诖嘶A(chǔ)上檢測(cè)了這些miRNAs在心肌肥大模型中的表達(dá)變化,結(jié)果篩選發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p、miR-199a-5p分別在右心肥大和左心肥大中表達(dá)上調(diào)最為顯著,預(yù)示其可能在心肌肥大形成中具有重要作用。為此,本研究擬在我們預(yù)實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)上,探討了miR-135a-5p和 miR-199a-5p分別在右心肥大和左心肥大發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制,旨在為深化對(duì)心肌肥大發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和尋找新的有效分子靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:<

4、br>　　1. miR-135a-5p在PAH致大鼠右心肥大中的作用及初步機(jī)制的研究方法:
　　1.1.右心肥大模型制備及給藥:雄性SD大鼠,一次性皮下注射野百合堿(MCT)(60mg/kg),對(duì)照組注射等量的生理鹽水,分別于1周、2周、3周、4周后取材。
　　1.2.密切觀察大鼠的一般狀況。4周時(shí),檢測(cè)大鼠mPAP、RVSP,測(cè)定大鼠右心肥大指數(shù)(RVHI)、右心質(zhì)量指數(shù)(RVMI)和肺指數(shù)(LI);大鼠肺組織及右心室組織

5、進(jìn)行HE染色,并在光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化;RT-qPCR方法檢測(cè)大鼠肺組織 miRNAs的表達(dá),篩選表達(dá)水平顯著的miRNAs。
　　1.3.分別在右心肥大造模1周、2周、3周、4周后用RT-qPCR方法檢測(cè)大鼠肺組織中miR-135a-5p的表達(dá)。
　　1.4.培養(yǎng)原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs),并用3％O2制備PASMCs增殖模型;分別在造模6h、12h、18h、24h、48h時(shí)采用RT-qPCR方法檢測(cè)PASM

6、Cs中的miR-135a-5p表達(dá)。
　　1.5.轉(zhuǎn)染miR-135a-5p模擬物或抑制物至PASMCs中,用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖、[3H]-亮氨酸摻入量、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)mRNA表達(dá),探討miR-135a-5p對(duì)3%O2誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響。
　　2.miR-199a-5p在腹主動(dòng)脈縮窄(TAC)致大鼠左心肥大中的作用及初步機(jī)制的研究方法:
　　2.1.

7、左心肥大模型制備及給藥:雄性SD大鼠,采用TAC致左心肥大模型;隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、氯沙坦組。氯沙坦組給予10mg/kg/d氯沙坦鉀;假手術(shù)組與模型組給予等量生理鹽水,連續(xù)4周。
　　2.2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中密切觀察大鼠的一般狀況。4周時(shí),處死大鼠,測(cè)定大鼠心臟肥大指數(shù)(CMI)和左心肥大指數(shù)(LVMI);大鼠左心室組織進(jìn)行HE染色,在光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化;RT-qPCR方法檢測(cè)大鼠左心室組織miR-199a-5p的表達(dá)。

8、r>　　2.3.體外培養(yǎng)原代SD乳鼠心肌細(xì)胞,并用AngⅡ制備心肌細(xì)胞肥大模型,AngⅡ刺激心肌細(xì)胞12h后采用RT-qPCR檢測(cè)miR-199a-5p的表達(dá)。
　　2.4.制備AngⅡ致心肌細(xì)胞肥大模型,轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物或者抑制物至心肌細(xì)胞中,[3H]-亮氨酸摻入法檢測(cè)蛋白合成。
　　結(jié)果:
　　1.miR-135a-5p在PAH致大鼠右心肥大中的作用及初步機(jī)制的結(jié)果:
　　1.1.MCT模型組

9、有40%大鼠死亡,其余存活MCT模型大鼠一般狀況較對(duì)照組差,其體重明顯降低(p<0.01)。4周時(shí),大鼠mPAP、RVSP顯著增高(p<0.01,p<0.01);RVHI、RVMI、LI明顯升高(p<0.01,p<0.01,p<0.01);肺血管管腔狹窄、右心室心肌細(xì)胞肥大;miR-135a-5p、miR-211-5p、miR-204-5p、miR-224-5p、miR-93-5p、miR-17-5p表達(dá)水平均上調(diào),其中miR-135a

10、-5p表達(dá)上調(diào)最為顯著。
　　1.2.在MCT誘導(dǎo)的PAH致大鼠右心肥大模型中,造模1周時(shí),與對(duì)照組相比, miR-135a-5p表達(dá)明顯降至對(duì)照組的27.53%(p<0.01);2周時(shí),其表達(dá)水平降至對(duì)照的34.5%;3周時(shí),其表達(dá)水平降至對(duì)照組的53.5%,miR-135a-5p表達(dá)呈上升趨勢(shì);4周時(shí),其表達(dá)水平為對(duì)照組的965%(p<0.01)。
　　1.3.在體外3%O2制備的PASMCs增殖模型中,RT-qPCR方

11、法檢測(cè)到miR-135a-5p表達(dá)在6h、12h、18h、24h、48h時(shí)無(wú)顯著變化。
　　1.4.在3%O2制備的PASMCs增殖模型中,30nM miR-135a-5p模擬物能顯著抑制3%O2誘導(dǎo)的PASMCs增殖(p<0.01),10nM miR-135a-5p模擬物對(duì)3%O2誘導(dǎo)的PASMCs增殖無(wú)顯著影響;10nM、30nM miR-135a-5p模擬物能顯著抑制[3H]-亮氨酸摻入量增加(p<0.05,p<0.01);

12、30nM miR-135a-5p模擬物能顯著抑制增殖指數(shù)的增加和 PCNA mRNA表達(dá)水平的增加(p<0.01,p<0.01);10、30nM miR-135a-5p抑制物對(duì)3%O2誘導(dǎo)的PASMCs增殖、[3H]-亮氨酸摻入量增加、增殖指數(shù)增加、PCNAmRNA表達(dá)水平增加無(wú)顯著影響。
　　2.miR-199a-5p在TAC致大鼠左心肥大中的作用及初步機(jī)制的結(jié)果:
　　2.1.假手術(shù)組、模型組、氯沙坦組的大鼠分別死亡3、

13、3、4只,組間無(wú)顯著差異。4周時(shí),與對(duì)照組相比,模型組大鼠CMI和LVMI均明顯增加(p<0.01,p<0.05),HE染色觀察左心室心肌細(xì)胞明顯肥大,左心室心肌miR-199a-5p表達(dá)顯著增加(p<0.01);與模型組相比,AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦可顯著抑制心肌肥大的同時(shí)顯著降低miR-199a-5p的表達(dá)(p<0.05)。
　　2.2.在AngⅡ刺激乳鼠心肌細(xì)胞肥大的模型中,氯沙坦可顯著抑制miR-199a-5p在AngⅡ誘

14、導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中表達(dá)水平的升高(p<0.05)。
　　2.3.miR-199a-5p抑制物可顯著抑制AngⅡ致心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入的增加(p<0.01);miR-199a-5p模擬物可顯著增加心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入(p<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.在PAH致右心肥大模型中,miR-135a-5p表達(dá)水平在1周時(shí)顯著降低;2周、3周時(shí)miR-135a-5p表達(dá)水平有上升趨勢(shì),但仍低于對(duì)照組;4周時(shí)其

15、表達(dá)顯著升高;結(jié)合體外miR-135a-5p可抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖的發(fā)現(xiàn),提示miR-135a-5p可能是改善肺血管重構(gòu)進(jìn)而防治右心肥大的新靶標(biāo)。
　　2.miR-199a-5p在TAC致左心肥大的發(fā)生過(guò)程中表達(dá)升高,AngⅡ受體抑制劑氯沙坦在抑制AngⅡ活性、改善心肌肥大的同時(shí)顯著降低miR-199a-5p表達(dá)水平;結(jié)合體外下調(diào)miR-199a-5p的表達(dá)能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的發(fā)現(xiàn),表明miR-199a