miR-17-5p通過調(diào)控極低密度脂蛋白受體的表達(dá)參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性疾病，主要癥狀為大中動(dòng)脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜增厚，形成粥樣斑塊。動(dòng)脈粥樣硬化是中風(fēng)、心肌梗死、缺血性心力衰竭和其他心臟病的主要原因，在西方國家，50％的死亡根本原因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中，血管平滑肌細(xì)胞的作用至關(guān)重要，它的異常增殖、遷移和分化導(dǎo)致了血管的病理學(xué)變化。內(nèi)膜增厚也是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的一項(xiàng)典型病理特征。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，它能夠與靶基因mRNA的3'

2、UTR區(qū)堿基互補(bǔ)，引導(dǎo)沉默復(fù)合物降解靶標(biāo)分子或者抑制mRNA的翻譯。在過去十年的研究中表明，miRNA在各種心血管疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮調(diào)控作用。也有一些研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與miRNA的異常表達(dá)高度相關(guān)。曾經(jīng)有報(bào)道m(xù)iR-17-5p可以用來作為診斷冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的分子標(biāo)記，具有很高的特異性和靈敏度。但是miR-17-5p在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的具體作用和機(jī)制還不清楚，因此，本研究通過臨床樣本檢測、動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，初步探討miR-

3、17-5p在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的作用和機(jī)制。
　　極低密度脂蛋白受體(VLDLR)屬于LDLR超家族的成員之一，是主要在心臟、肌肉、脂肪細(xì)胞和腦中表達(dá)的外周脂蛋白受體。它能夠與含有載脂蛋白E的脂蛋白結(jié)合，如極低密度脂蛋白、乳糜微粒、中間密度脂蛋白等。在LDLR缺陷型小鼠中用腺病毒介導(dǎo)的肝臟中VLDLR過表達(dá)，顯示出VLDLR在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病變形成以及脂肪條紋病變的潛力。目前認(rèn)為，VLDLR也是動(dòng)脈粥樣硬化表達(dá)中重要的調(diào)控因子。

4、本研究發(fā)現(xiàn)，VLDLR可能是miR-17-5p的潛在靶分子，基于此預(yù)測，本研究提出了一條基于新的miRNA調(diào)控通路的科學(xué)假設(shè)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，具有十分重要的理論和應(yīng)用價(jià)值，有利于探索新的藥物靶點(diǎn)，將會(huì)為動(dòng)脈粥樣硬化的診斷和治療提供新的方向。以下為本研究各部分內(nèi)容的概述:
　　第一部分動(dòng)脈粥樣硬化患者中miR-17-5p與VLDLR的表達(dá)相關(guān)性
　　目的:明確動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病與miR-17-5p、VLDLR的相關(guān)性。
　　

5、方法:以30對來源于動(dòng)脈粥樣患者和健康人群的外周血樣本為研究材料，通過Real-time PCR檢測各樣本中miR-17-5p和VLDLR mRNA表達(dá)量，對比miR-17-5p及VLDLR在動(dòng)脈粥樣硬化組和健康對照組之間的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:Real-time PCR檢測miR-17-5p表達(dá)結(jié)果顯示，動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中的miR-17-5p的表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.01)。Real-time PCR檢測VLDLR的

6、結(jié)果顯示，VLDLR mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.01）。
　　結(jié)論:(1)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病與外周血中miR-17-5p的表達(dá)水平呈正相關(guān)。(2)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病與外周血中VLDLR的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中miR-17-5p對動(dòng)脈粥樣硬化的影響
　　目的:探討miR-17-5p對動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的影響，初步闡述其作用機(jī)制;評估m(xù)iR-17-5p作為治療動(dòng)脈粥樣硬化靶位點(diǎn)的應(yīng)用價(jià)值

7、。
　　方法:用高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，注射antagomiR-17-5p及NC miRNA干擾小鼠體內(nèi)的miR-17-5p的表達(dá)。通過HE染色檢測各組小鼠動(dòng)脈血管的病理變化，測量各組小鼠血管內(nèi)膜、中膜面積，計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)，測量管腔面積，探討干擾miR-17-5p對動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用。通過免疫熒光、Real-time PCR、Western blot檢測各組小鼠動(dòng)脈組織中VLD

8、LR的表達(dá)，Real-time PCR、Western blot檢測PCSK9的表達(dá)，Western blot檢測Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP蛋白的表達(dá)， ELISA檢測血管炎癥因子(TNF-α、IL-6，IL-10)水平，試劑盒法檢測MDA、SOD及髓過氧化物酶(MPO)水平及活性，進(jìn)一步探討miR-17-5p作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示AS小鼠與對照組相比，其

9、血管內(nèi)皮形成了明顯的斑塊，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜增生，而antagomiR-17-5p處理的小鼠與NC miRNA組相比，病變程度明顯減輕。動(dòng)脈粥樣硬化小鼠比對照小鼠的內(nèi)膜面積明顯增加，抑制miR-17-5p的作用之后，內(nèi)膜面積減少;各組小鼠中中膜面積差異不顯著。計(jì)算I/M值，antagomiR-17-5p組小鼠比NC-miRNA組顯著減小(P＜0.05)。AS模型組和NC-miRNA組小鼠的血管管腔面積比對照組明顯減小，而antag

10、omiR-17-5p組則緩解了這種作用，結(jié)果差異具有顯著性(P＜0.05)。免疫熒光、Real-time PCR、Western blot檢測各組小鼠動(dòng)脈組織中VLDLR的表達(dá)，結(jié)果顯示動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中VLDLR的表達(dá)量顯著下降，抑制miR-17-5p的作用使得VLDLR水平上升。通過Real-time PCR和Western blot檢測PCSK9在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)變化，結(jié)果與VLDLR相反，在AS模型組中PCSK9在mR

11、NA和蛋白水平上的表達(dá)量均顯著上調(diào)，在antagomiR-17-5p組中表達(dá)量顯著下調(diào)。Western blot檢測結(jié)果顯示，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2水平降低，抑制miR-17-5p的作用使Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)水平降低，Bcl-2水平上調(diào);ELISA檢測結(jié)果顯示，AS模型小鼠TNF-α、IL-6水平升

12、高，IL-10水平降低，抑制miR-17-5p的作用后則TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平上調(diào);細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果表明，AS模型小鼠MDA、MPO水平上調(diào)，SOD活性降低，抑制miR-17-5p的作用能夠抑制MDA、MPO水平及活性，上調(diào)SOD酶活性。
　　結(jié)論:(1)抑制miR-17-5p對小鼠中的動(dòng)脈硬化具有顯著的治療作用，能夠有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化小鼠動(dòng)脈血管的病理變化，減少斑塊的形成，緩解AS造成的內(nèi)膜增生和

13、管腔狹窄。(2)干擾miR-17-5p的表達(dá)量上調(diào)動(dòng)脈組織中VLDLR的表達(dá)量。(3)干擾miR-17-5p的表達(dá)量下調(diào)動(dòng)脈組織中PCSK9的表達(dá)。(4)干擾miR-17-5p的表達(dá)量抑制動(dòng)脈組織中細(xì)胞凋亡。(5)干擾miR-17-5p的表達(dá)量抑制動(dòng)脈組織中炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激。
　　第三部分 miR-17-5p直接調(diào)控平滑肌細(xì)胞中VLDLR的表達(dá)
　　目的:探討miR-17-5p在血管平滑肌細(xì)胞中靶向VLDLR調(diào)控其表達(dá)的機(jī)

14、制;
　　方法:利用TargetScan對miR-17-5p和VLDLR之間的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測;體外培養(yǎng)人的血管平滑肌細(xì)胞，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-17-5p對VLDLR的直接調(diào)控作用。在血管平滑肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor及其對照，然后通過Real-time PCR和Western blot檢測VLDLR的表達(dá)量。構(gòu)建PCSK9重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞，然后通過Real-time PCR和W

15、estern blot檢測VLDLR的表達(dá)量變化。
　　結(jié)果:TargetScan在線網(wǎng)站對miR-17-5p與VLDLR之間相互作用的預(yù)測結(jié)果顯示VLDLR可能是miR-17-5p的潛在靶位點(diǎn)。在血管平滑肌細(xì)胞中進(jìn)行的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VLDLR3'UTR與miR-17-5p共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致熒光素酶活性顯著下降，表明miR-17-5p能夠直接結(jié)合VLDLR3'UTR區(qū)，抑制VLDLR的表達(dá)。對VLDLR的Real-time PCR

16、和Western blot的檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor之后，VLDLR的表達(dá)量明顯上升(P＜0.01)。Real-time PCR和Western blot的檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PCSK9之后，VLDLR的表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)
　　結(jié)論:(1) miR-17-5p直接靶向VLDLR mRNA的3'UTR區(qū)，下調(diào)VLDLR的表達(dá)。(2)抑制血管平滑肌細(xì)胞中miR-17-5p的表達(dá)，可以提高VLDLR