miR-142-5p在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)及通過(guò)TGF-β2調(diào)控人巨噬細(xì)胞凋亡功能的作用.pdf

1、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，coronaryheartdisease，CHD)近年的發(fā)病率和死亡率逐年上升，成為威脅人類健康的重大主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的一個(gè)主要的危險(xiǎn)因素，近年研究表明microRNAs在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及發(fā)展過(guò)程中參與并起著重要的基因調(diào)控作用。動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的進(jìn)展中，microRNAs參與了包括內(nèi)皮功能的變化、血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、巨噬細(xì)胞的功能以及泡沫細(xì)胞的形成。巨噬細(xì)胞參與先

2、天免疫系統(tǒng)，幫助清除凋亡細(xì)胞和去除細(xì)胞碎片產(chǎn)生的組織重構(gòu)和細(xì)胞壞死;巨噬細(xì)胞可以釋放炎性物質(zhì)，影響動(dòng)脈粥樣硬化。在冠心病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，炎癥起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs不但參與了炎癥細(xì)胞的發(fā)育、分化，還參與調(diào)控炎癥細(xì)胞的活化以及各種炎癥因子的相互作用。mir-142-5p目前在腫瘤、免疫疾病、淋巴組織及紅細(xì)胞胚胎干細(xì)胞方面都有研究，但在動(dòng)脈粥樣硬化方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 研究目的：
　　 (1)探

3、討mir-142-5p在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)的變化;
　　 (2)進(jìn)一步探討mir-142-5p在人巨噬細(xì)胞中的表達(dá);
　　 (3)探討mir-142-5p的靶基因并觀察其對(duì)人巨噬細(xì)胞凋亡功能的影響。
　　 方法：
　　 1.1、動(dòng)物模型的構(gòu)建
　　 實(shí)驗(yàn)選用8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，在普食喂養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)為高脂喂養(yǎng);2周后給予右側(cè)頸動(dòng)脈套管術(shù);給予套管高脂飲食8周，根據(jù)干預(yù)措施不同分為3組（

4、12只/組）:空白對(duì)照組;穩(wěn)定斑塊組;易損斑塊組。易損斑塊組給予限制性應(yīng)激及噪音干預(yù)4周（前兩周4h/天，后2周6h/天，5天/周）后，行麻醉處死小鼠采集血樣、收集樣本入液氮罐中。
　　 1.2、microRNA芯片檢測(cè)
　　 將取材后的頸動(dòng)脈血管在冰上清理后送康城生物公司進(jìn)行microRNA芯片檢測(cè)，篩查在易損斑塊表達(dá)變化較明顯的microRNA，明確mir-142-5p在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)變化。
　　

5、1.3、觀察mir-142-5p在血管壁不同細(xì)胞中的表達(dá)，選擇變化明顯的細(xì)胞進(jìn)一步研究
　　 在人平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用ox-LDL刺激，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)比較mir-142-5p在不同細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　 1.4、尋找mir-142-5p的靶基因
　　 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)mir-142-5p的靶基因:TGF-β2;通過(guò)脂質(zhì)體2000將mir-142-5p的inhibitor及mi

6、mics轉(zhuǎn)染進(jìn)入人巨噬細(xì)胞中，應(yīng)用Western-bolt及RT-PCR技術(shù)對(duì)靶基因TGF-β2進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 1.5、mir-142-5p及TGF-β2干預(yù)對(duì)人巨噬細(xì)胞凋亡功能的影響
　　 應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將mir-142-5p的inhibitor、mimics及TGF-β2的inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)入人巨噬細(xì)胞中，通過(guò)AnnexinV-PE(AnnexinV-PEApoptosisDetectionKit)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

7、試劑盒在激光共聚焦顯微鏡下觀察其對(duì)人巨噬細(xì)胞功能的影響。
　　 1.6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 兩組之間的差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組之間差異的比較采用了方差分析(ANOVA)。以上結(jié)果應(yīng)用了SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 2.1、mir-142-5p在斑塊中的表達(dá)
　　 MicroRNA芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，mir-142-5p在穩(wěn)定斑塊組中的

8、表達(dá)比空白對(duì)照組高6.8倍;mir-142-5p在易損斑塊組中的表達(dá)比空白對(duì)照組高2.7倍。
　　 2.2、mir-142-5p在三種細(xì)胞中的表達(dá)
　　 培養(yǎng)人內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，并用ox-LDL50ng/ml刺激24h后提取microRNA并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mir-142-5p在三種細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞中mir-142-5p的表達(dá)在對(duì)照組與ox-LDL干預(yù)組間差異均低于1.5倍（P

9、＞0.05），而mir-142-5p在巨噬細(xì)胞ox-LDL干預(yù)組中的表達(dá)高于對(duì)照組5.4倍（P＜0.05），與芯片結(jié)果趨勢(shì)符合。
　　 2.3、mir-142-5p的靶基因預(yù)測(cè)
　　 應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)mir-142-5p的靶基因可能為:TGF-β2;通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)將mir-142-5p的inhibitor及mimics轉(zhuǎn)染進(jìn)入人巨噬細(xì)胞中，提取蛋白及RNA，Western-bolt及RT-PCR的結(jié)果均提示TG

10、F-1β2可能為mir-142-5p的靶基因。
　　 2.4、Mir-142-5p及TGF-β2干預(yù)對(duì)人巨噬細(xì)胞凋亡功能的影響
　　 control組細(xì)胞基本無(wú)凋亡;與control組比較，ox-LDL組細(xì)胞凋亡增加（凋亡細(xì)胞率:6.83+0.17％，P＜0.05）;mir-142-5pmimics+ox-LDL組（凋亡細(xì)胞率:5.27±0.19％）和TGF-β2inhibitor+mir-142-5pinhibitor

11、+ox-LDL組（凋亡細(xì)胞率:1.38±0.27％）及TGF-β2inhibitor+ox-LDL組（凋亡細(xì)胞率:2.74±0.21％）細(xì)胞凋亡也較ox-LDL組少(P＜0.05);與其它組比較mir-142-5pinhibitor+ox-LDL組凋亡細(xì)胞最多(凋亡細(xì)胞率:12.31+0.22％，P＜0.05)。凋亡細(xì)胞率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)％。
　　 結(jié)論：
　　 1、mir142-5p在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)上調(diào)。