P4Hα1與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的關(guān)系及miR-124的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、論文Ⅰ:
　　 過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響
　　 1.背景
　　 目前，心腦血管病仍然是全球引起致死致殘的主要原因，而且心腦血管病的發(fā)病率仍然呈上升趨勢(shì)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性與斑塊內(nèi)膠原含量減少密切相關(guān)。增加斑塊中膠原含量，對(duì)穩(wěn)定斑塊，減少斑塊破裂，降低臨床血管事件的發(fā)生具有重要的意義。
　　 Ⅰ型、Ⅲ型膠原是動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊中主要的膠原類型，在斑塊重塑過(guò)程中發(fā)揮著

2、重要作用。成熟的Ⅰ型和Ⅲ型膠原，尤其是纖維帽中的膠原大分子可形成保護(hù)層，對(duì)抗斑塊外的拉力及剪切力的應(yīng)變，是防止斑塊破裂的有效阻抗。除此之外，Ⅰ型和Ⅲ型膠原能抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增生和遷移，減少基質(zhì)金屬蛋白酶與炎性因子釋放，與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。
　　 P4Hα1膠原合成的關(guān)鍵酶。能通過(guò)膠原的翻譯后修飾作用促進(jìn)膠原的成熟與分泌。理論上，在前膠原表達(dá)豐富的前提下，過(guò)表達(dá)膠原合成的關(guān)鍵酶P4Hα1能夠促進(jìn)脯氨酸的羥化，從而增加成熟膠

3、原的表達(dá)。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是脂質(zhì)和膠原等成份在大中型動(dòng)脈內(nèi)中膜的異常聚集。它是一個(gè)漸進(jìn)的病理過(guò)程。不同時(shí)期的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有不同的組織學(xué)特征。斑塊內(nèi)的各種成分所占的比例也隨斑塊的不同階段而有所增減。同樣，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過(guò)程中P4Hα1的表達(dá)也會(huì)有所不同，明確P4Hα1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)理解動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病理過(guò)程及正確選擇治療干預(yù)的時(shí)間窗具有一定的意義。
　　 研究表明，動(dòng)脈粥樣硬

4、化斑塊中膠原成分的減少與急性血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。目前公認(rèn)的易損斑塊的組織學(xué)特征是纖維帽薄，膠原含量少，脂質(zhì)含量多(＞40％)，炎性因子浸潤(rùn)，伴有血管的正性重構(gòu)。文獻(xiàn)表明，P4Hα1能有效的促進(jìn)膠原的合成，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的Ⅰ型、Ⅲ型膠原能有效的穩(wěn)定斑塊，降低斑塊的的易損指數(shù)。我們以往的許多研究措施可以間接地通過(guò)提高斑塊中P4Hα1的表達(dá)而增加斑塊內(nèi)膠原的含量，提高斑塊的穩(wěn)定性。但是直接在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中過(guò)表達(dá)P4Hα1觀察斑塊穩(wěn)

5、定性的研究，到目前為止尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。
　　 此外，PTEN是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，具有抑癌作用，同時(shí)，還參與細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，與細(xì)胞體積大小及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有密切關(guān)系。在血管病中，被稱為平滑肌細(xì)胞增生的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能抑制早期斑塊新生內(nèi)膜的增生，并且膠原與PTEN的關(guān)系密切。但是，斑塊中過(guò)表達(dá)P4Hα1，對(duì)PTEN有何影響，到目前為止，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　 基于此，提出本研究的科學(xué)假說(shuō)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的早

6、、晚不同期，即套管4周的斑塊和套管12周的斑塊中過(guò)表達(dá)P4Hα1，能增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中P4Hα1蛋白的表達(dá)，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量，降低斑塊的易損指數(shù)，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的作用。不同階段斑塊的組織學(xué)特征及形態(tài)學(xué)特征可能與過(guò)表達(dá)P4Hα1影響PTEN的表達(dá)有關(guān)。
　　 研究目的：
　　 (1)探討ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過(guò)程中P4Hα1的表達(dá)變化規(guī)律。
　　 (2)在ApoE-/-小鼠

7、早、晚不同時(shí)期的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中轉(zhuǎn)染P4Hα1慢病毒，觀察P4Hα1對(duì)斑塊的組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及易損性的影響。
　　 (3)在分子生物學(xué)、組織學(xué)水平探討過(guò)表達(dá)P4Hα1作用的可能機(jī)制。
　　 2.材料和方法
　　 2.1、構(gòu)建含目的基因的病毒載體
　　 由上海inventrogen公司用化學(xué)合成的方法合成目的基因P4Hα1并攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的慢病毒載體(Lenti-P4Hα1)，及僅攜帶增強(qiáng)型

8、綠色熒光蛋白報(bào)告基因但無(wú)目標(biāo)基因P4Hα1的陰性對(duì)照空病毒載體(Lenti-EGFP)。
　　 2.2、構(gòu)建小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型
　　 購(gòu)買北京大學(xué)維通利華動(dòng)物技術(shù)公司的8周齡ApoE-/-雄性小鼠，全程高脂飲食（含0.25％膽固醇和15％脂肪）喂養(yǎng)。
　　 2.2.1、構(gòu)建小鼠主動(dòng)脈根部自發(fā)粥樣硬化斑塊模型
　　 ApoE-/-雄性小鼠（8周齡，80只），全程高脂飲食（含0.25％膽固醇和15％脂肪

9、）喂養(yǎng)。隨機(jī)分為4組:10周齡組、12周齡組、14周齡組、16周齡組;每組20只。高脂喂養(yǎng)至10周齡、12周齡、14周齡、16周齡，行安樂(lè)死處死動(dòng)物，取材檢測(cè)。見(jiàn)流程圖1.
　　 2.2.2、構(gòu)建小鼠頸總動(dòng)粥樣硬化斑塊模型
　　 為誘發(fā)頸總動(dòng)脈斑塊形成，8周齡ApoE-/-雄性小鼠行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)。基因轉(zhuǎn)染干預(yù)后并分別于套管術(shù)后4周（套管4周的斑塊）及12周（套管12周的斑塊）取材，進(jìn)行檢測(cè)。
　　 頸動(dòng)脈套

10、管和基因轉(zhuǎn)染流程
　　 (1)頸動(dòng)脈套管:8周齡ApoE-/-雄性小鼠行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)，用0.08％戊巴比妥鈉(40mg/Kg)，術(shù)前行腹腔注射麻醉。將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)，用脫毛劑給予頸部脫毛處理后，碘酒消毒。沿頸正中線小心地切開(kāi)皮膚。分離腺體與肌肉，暴露氣管，將腺體上翻，清晰看到右側(cè)頸總動(dòng)脈，小心分離，避免損傷伴行的迷走神經(jīng)。將預(yù)先剖開(kāi)消毒處理的硅膠套管輕柔小心地套于頸總動(dòng)脈上，絲線結(jié)扎固定套管。恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)層次后，縫合皮膚

11、切口。
　　 (2)基因轉(zhuǎn)染流程:
　　 ①套管4周的斑塊干預(yù)組:60只8周齡ApoE-/-雄性小鼠，右側(cè)頸動(dòng)脈套管術(shù)后2周，隨機(jī)分為三個(gè)亞組:生理鹽水組（Mock組），空病毒組(Lenti-EGFP組)和P4Hα1組（Lenti-P4Hα1組），每組20只。分別小鼠尾靜脈注射20ml生理鹽水，空病毒(Lenti-EGFP，1.75×108Tfu/ml，20ul)，攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的慢病毒載體(Lenti-

12、P4Hα1，1.75×108Tfu/ml，20ul)的懸液。轉(zhuǎn)染2周行安樂(lè)死后取材。見(jiàn)流程圖2。
　　 ②套管12周的斑塊干預(yù)組:60只右側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)后8周開(kāi)始給予精神應(yīng)激刺激，刺激持續(xù)到術(shù)后12周。精神應(yīng)激刺激方法:將實(shí)驗(yàn)小鼠封閉于50ml大小、帶有通氣孔的塑料管中，給與強(qiáng)度為110dB的噪音刺激，噪音刺激間隔為5分鐘，每次持續(xù)3秒，每天持續(xù)6小時(shí)，共刺激四周到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。基因轉(zhuǎn)染:套管術(shù)后10周，所有實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為生理鹽

13、水組（Mock組），空病毒組(Lenti-EGFP組)和P4Hα1組（Lenti-P4Hα1組），每組20只。分別小鼠尾靜脈注射20ul生理鹽水，空病毒(Lenti-EGFP，1.75×108Tfu，20ul)，攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的慢病毒載體(Lenti-P4Hαl，1.75×108Tfu/ml，20ul)的懸液。轉(zhuǎn)染2周后予以安樂(lè)死后取材生理鹽水組。見(jiàn)流程圖3。
　　 2.3、顯微超聲檢測(cè)斑塊:顯微超聲影像系統(tǒng)Ve

14、vo7700(RMV708探頭)分別于套管術(shù)后2周、10周轉(zhuǎn)染干預(yù)前和4周、12周安樂(lè)死前行套管側(cè)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的血管超聲檢測(cè)。
　　 2.4、體重及血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè):分別于套管術(shù)后2周、10周轉(zhuǎn)染干預(yù)前和4周、12周安樂(lè)死前檢測(cè)小鼠體重;血脂水平;血清中羥脯氨酸水平。
　　 2.5、組織學(xué)檢測(cè):小心分離套管側(cè)頸總動(dòng)脈，常規(guī)冰凍切片后，分別行蘇木素-伊紅、天狼猩紅、油紅O染色。使用Image-ProPlus6.

15、0圖像分析軟件測(cè)量斑塊面積、纖維帽面積、纖維帽厚度、纖維帽中膠原含量及脂質(zhì)核面積并計(jì)算易損指數(shù)。
　　 2.6、免疫組化:
　　 頸動(dòng)脈組織冰凍切片漂洗后，常規(guī)行5％血清封閉，為檢測(cè)不同指標(biāo)，分別行相應(yīng)的一抗二抗孵育:P4Hα1、MOMA-2，α-actin，Ⅰ型，Ⅲ型前膠原，Ⅰ型及Ⅲ型膠原，IL-6、TNFa、MCP-1、MMP9，MMP2，TIMP-1，TIMP-2。使用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分

16、別計(jì)算以上不同指標(biāo)在相應(yīng)斑塊中的陽(yáng)性染色面積(％)。
　　 2.7、蛋白印跡檢測(cè):
　　 常規(guī)提取動(dòng)脈斑塊的組織蛋白，行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗二抗，發(fā)光。觀察目的蛋白P4Hα1、Ⅰ型及Ⅲ型膠原、MMP2、MMP9、PTEN的相對(duì)表達(dá)變化。Quantity-one圖像分析軟件分析計(jì)算三組中各種不同的目的蛋白的相對(duì)含量。
　　 2.8、實(shí)時(shí)定量檢測(cè):收集主動(dòng)脈根部或右側(cè)套管近心端頸總動(dòng)脈各組斑塊組織，常規(guī)提取總的m

17、RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)各組斑塊干預(yù)后P4Hα1、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)水平。
　　 2.9、明膠酶譜法:檢測(cè)MMP2/MMP9的活性。常規(guī)方法分別制備10％分離膠、4％濃縮膠;在10％的分離膠中加入明膠儲(chǔ)存液，至終濃度為0.1％;然后常規(guī)上樣、電泳。取下電泳后的凝膠，放入100ml酶譜復(fù)性緩沖液（2.5％TritonX-100）中，室溫條件下振蕩30min;再在酶譜顯影緩沖液中平衡30min;將凝膠置于新

18、鮮的酶譜顯影緩沖液中，37℃過(guò)夜;凝膠染色、脫色;分析條帶大小并測(cè)定灰度;計(jì)算相對(duì)量的變化。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況
　　 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生理鹽水組中1只小鼠死于麻醉，套管12周的斑塊P4Hα1組中1只小鼠死于轉(zhuǎn)染后第13天，解剖后發(fā)現(xiàn)明顯的肝硬化。余實(shí)驗(yàn)小鼠未觀察到局部和全身性的不良反應(yīng)，均完成實(shí)驗(yàn)。套管4周的斑塊組中的3組，與套管12周的斑塊組中3組的ApoE-/-小鼠的體重、及血脂指標(biāo):

19、TC、TG、LDL-C和HDL-C的血清水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而套管4周的斑塊組與套管12周的斑塊組中P4Hα1組中血清羥脯氨酸水平顯著高于生理鹽水組與空病毒組。
　　 3.2、顯微超聲檢測(cè)斑塊形成
　　 小鼠顯微血管超聲檢測(cè)顯示，套管2周套管側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，4周見(jiàn)小斑塊形成;10周、12周套管側(cè)的頸總動(dòng)脈有明顯斑塊形成。而對(duì)側(cè)未套管的頸總動(dòng)脈管腔光滑。
　　 3.3、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)
　

20、　 慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)于慢病毒轉(zhuǎn)染7天、10天、14天、21天、28天、35天后，分別取材，檢測(cè)粥樣硬化斑塊內(nèi)綠色熒光表達(dá)。慢病毒轉(zhuǎn)染14天P4Hα1組和空病毒組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)GFP表達(dá)率最高(70％)，而生理鹽水組的頸總動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)無(wú)GFP表達(dá)。證實(shí)體內(nèi)轉(zhuǎn)染有效。所以取慢病毒轉(zhuǎn)染2周取材作為本實(shí)驗(yàn)的慢病毒轉(zhuǎn)染干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。
　　 3.4、過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管4周的斑塊組織病理學(xué)的影響
　　 (1)過(guò)表達(dá)P4H

21、α1對(duì)套管4周的斑塊中P4Hα1表達(dá)的影響
　　 RT-PCR、Westernblot檢測(cè)及免疫組化染色顯示:三組比較，P4Hα1組P4Hα1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。
　　 (2)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管4周的斑塊中內(nèi)膠原表達(dá)的影響RT-PCR、Westernblot檢測(cè)及免疫組化染色顯示:三組比較，Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05);但P4Hα1組Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)顯著增

22、加(P＜0.05)。
　　 (3)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管4周的斑塊組份和易損指數(shù)的影響
　　 病理學(xué)染色顯示:三組比較，P4Hα1組膠原含量、平滑肌細(xì)胞含量顯著增加(P＜0.05);脂質(zhì)含量三組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）;P4Hα1組巨噬細(xì)胞含量顯著降低(P＜0.05);易損指數(shù)顯著顯著降低（P＜0.05）。
　　 (4)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管4周的斑塊纖維帽的影響
　　 HE及天狼星紅染色顯示:三組

23、比較，P4Hα1組斑塊平均纖維帽厚度顯著性增厚（P＜0.05）;纖維帽面積顯著增大（P＜0.05）;纖維帽中膠原的含量顯著增多(P＜0.05)。
　　 (5)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管4周的斑塊形態(tài)學(xué)的影響
　　 HE及油紅O染色顯示:三組比較，P4Hα1組斑塊的面積及主動(dòng)脈表面AS病變范圍顯著增大(P＜0.05)。
　　 (6)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管4周的斑塊中PTEN的表達(dá)影響
　　 免疫組化、Weste

24、rnblot顯示，P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較PTEN的陽(yáng)性染色面積，及PTEN的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著性減少（P＜0.05）。
　　 3.5、過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊組織病理學(xué)的影響
　　 (1)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊中P4Hα1表達(dá)的影響
　　 RT-PCR、Westernblot檢測(cè)及免疫組化染色顯示:P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較P4Hα1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(

25、P＜0.05)。
　　 (2)P4Hα1過(guò)表達(dá)對(duì)套管12周的斑塊內(nèi)膠原表達(dá)的影響
　　 RT-PCR、Westernblot檢測(cè)及免疫組化染色顯示:P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）;三組間Ⅰ型和Ⅲ型前膠原（Ⅰ型和Ⅲ型膠原）的mRNA的表達(dá)，及Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 (3)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊組份和易損指數(shù)

26、的影響
　　 病理學(xué)染色顯示:
　　 ①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較膠原含量顯著增加（P＜0.05）;
　　 ②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較平滑肌細(xì)胞含量顯著增加(P＜0.05);
　　 ③P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較脂質(zhì)含量三組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05)。
　　 ④P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較巨噬細(xì)胞含量顯著降低(P＜0.05);
　　 ⑤P4

27、Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較易損指數(shù)顯著顯著降低(P＜0.05);
　　 (4)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊內(nèi)纖維帽的影響HE及天狼星紅染色顯示:
　　 ①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較平均纖維帽厚度顯著性增厚(P＜0.05);
　　 ②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊的纖維帽面積顯著增大(P＜0.05);
　　 ③P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊的纖維帽中膠原的含

28、量顯著性增大(P＜0.05);
　　 (5)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊形態(tài)學(xué)的影響
　　 ①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊的面積三組之間無(wú)顯著地差異(P＞0.05);
　　 ②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較主動(dòng)脈表面AS病變范圍三組之間無(wú)顯著地差異(P＞0.05)。
　　 (6)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊內(nèi)炎性因子的影響
　　 斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、TNF-a

29、和MCP-1的免疫組化染色顯示:
　　 ①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)IL-6陽(yáng)性染色面積顯著性減小（P＜0.05）;
　　 ②P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)TNF-a陽(yáng)性染色面積顯著性減小(P＜0.05);
　　 ③P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)MCP-1陽(yáng)性染色面積顯著性減小(P＜0.05);
　　 (7)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶表

30、達(dá)的影響斑塊內(nèi)MMP9、MMP2、TIMP-1、TIMP-2的免疫組化染色及Westernblot顯示:
　　 ①P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較斑塊內(nèi)MMP9、MMP2的陽(yáng)性染色面積顯著性減?。≒＜0.05）;相反，TIMP-1、TIMP-2的陽(yáng)性染色面積顯著性增大(P＜0.05);
　　 ②Westernblot顯示，P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較MMP9、MMP2的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著性減少（P＜0.0

31、5）;
　　 ③基質(zhì)金屬蛋白酶原位酶譜法檢測(cè)顯示:P4Hα1組與空病毒組和生理鹽水組比較MMP9、MMP2活性顯著性降低（P＜0.05）;
　　 (8)過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)套管12周的斑塊中PTEN的表達(dá)影響
　　 ①免疫組化顯示，三組中PTEN的陽(yáng)性染色面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 ②Westernblot顯示出相同的趨勢(shì):三組中PTEN的蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　

32、4.結(jié)論
　　 (1)在ApoE-/-小鼠脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過(guò)程中，P4Hα1的表達(dá)逐漸減少。
　　 (2)在ApoE-/-小鼠套管4周的斑塊及套管12周的斑塊中，過(guò)表達(dá)P4Hα1均能升高斑塊中膠原的含量，降低易損指數(shù)，但在套管4周的斑塊模型中過(guò)表達(dá)P4Hα1卻促使斑塊增大和主動(dòng)脈表面斑塊總負(fù)荷的增多。
　　 (3)過(guò)表達(dá)P4Hα1促進(jìn)套管4周的斑塊的增大及主動(dòng)脈表面斑塊總負(fù)荷的增多，與過(guò)表達(dá)P4Hα1抑制了PT

33、EN的表達(dá)有關(guān)。
　　 論文Ⅱ
　　 MicroRNA-124調(diào)控P4Hα1影響平滑肌細(xì)胞膠原合成的分子機(jī)制
　　 1.背景
　　 MicroRNA(miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA分子，長(zhǎng)度約為18-24個(gè)核苷酸，能夠特異地結(jié)合于靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR），干擾靶基因的翻譯或促進(jìn)靶基因mRNA的降解。從而抑制靶蛋白在體內(nèi)的表達(dá)。MicroRNA與其靶基因之間構(gòu)

34、成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，每個(gè)MicroRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，而多個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人體內(nèi)約60％以上的基因，在人體細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　 研究表明，膠原的減少與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)。P4Hα1是膠原合成的限速酶，能使前膠原(procollagen)肽鏈上的脯氨酸羥化成為羥基脯氨酸，促進(jìn)膠原的成熟與分泌。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明，炎性因子

35、如IL-6通過(guò)MAPK和c-Jun分子通路，下調(diào)P4Hα1的表達(dá)，降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性;TNFa通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子Nono的甲基化等表觀遺傳學(xué)的調(diào)控而降低P4Hα1的表達(dá)。相反，脂連素則可以通過(guò)MAPK-AP1分子傳導(dǎo)通路上調(diào)P4Hα1的表達(dá)，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。但是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MicroRNA分子與調(diào)節(jié)膠原合成的關(guān)鍵酶P4Hα1的關(guān)系如何目前尚無(wú)相關(guān)的研究報(bào)道。
　　 MicroRNA124（miR-12

36、4）最早在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤-神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤的病理調(diào)控過(guò)程。以后，又發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)脈粥樣硬化性腹主動(dòng)脈瘤中高表達(dá)。提示miR-124可能與動(dòng)脈重構(gòu)過(guò)程中膠原的代謝有關(guān)。Micro.org.等多個(gè)MicroRNA應(yīng)用軟件均推測(cè)miR-124能特異的與P4Hα1的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合，并且結(jié)合能低，P4Hα1是miR-124理論上的靶基因。那么miR-124是否在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)揮作用？是否與斑塊的膠原代謝有關(guān)？能否調(diào)控

37、P4Hα1，能否進(jìn)一步影響膠原的合成？到目前為止尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。
　　 本研究提出如下假說(shuō):
　　 (1)miR-124在應(yīng)激條件下的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與非應(yīng)激條件下的斑塊中的表達(dá)不同，在應(yīng)激條件下的粥樣硬化斑塊中表達(dá)上調(diào)。
　　 (2)P4Hα1是miR-124特定的靶基因。在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中上調(diào)miR-124能特異的抑制P4Hα1蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步降低Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成。相反，抑制主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中miR

38、-124的表達(dá)，促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成。
　　 研究目的
　　 (1)觀察ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊應(yīng)激組與非應(yīng)激組中MicroRNA124(miR-124)與P4Hα1表達(dá)變化關(guān)系。
　　 (2)驗(yàn)證miR-124能特異地結(jié)合于P4Hα13'端非翻譯區(qū)，明確P4Hα1是miR-124作用靶基因的分子機(jī)制。
　　 (3)探討miR-124是否能調(diào)節(jié)P4Hα1，進(jìn)而影響主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中膠原的成熟

39、和表達(dá)。
　　 2.材料和方法
　　 (1)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型:動(dòng)物來(lái)源和頸動(dòng)脈套管術(shù)同論文一60只套管后8周的ApoE-/-小鼠，隨機(jī)分成兩組:
　　 ①應(yīng)激斑塊組:頸動(dòng)脈套管術(shù)后給予脂多糖與應(yīng)激刺激以誘發(fā)斑塊中的炎癥反應(yīng)，應(yīng)激刺激的方法同論文一。
　　 ②非應(yīng)激組:不給予脂多糖與應(yīng)激刺激，僅持續(xù)高脂喂養(yǎng)。見(jiàn)流程圖1。
　　 (2)設(shè)計(jì)與合成miR-124特異性引物
　　 miR-

40、124特異性引物的設(shè)計(jì)與合成由丹麥Exiqon公司提供（本公司不提供引物序列）。
　　 (3)設(shè)計(jì)與合成miR-124特異性引物模擬物及抑制物
　　 使用化學(xué)合成的方法合成miR-124mimics及miR-124inhibitors。由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司提供。
　　 (4)構(gòu)建含有P4Hα1-3'-UTR的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒
　　 分別構(gòu)建含有野生型P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)序列3'-UTR

41、(P4Hα1-3'-UTR-WT)、突變型P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)序列3'-UTR(P4Hα1-3'-UTR-MUT)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3):pGL3-P4Hα1-3'-UTR-WT和pGL3-P4Hα1-3'-UTR-MUT。通過(guò)脂質(zhì)體2000和miR-124mimic共轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶熒光表達(dá)強(qiáng)度。驗(yàn)證軟件預(yù)測(cè)結(jié)果。明確miR-124與P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)特異的堿基互補(bǔ)結(jié)合序列。探討m

42、iR-124調(diào)控的下游靶基因P4Hα1的分子機(jī)制。
　　 (5)miRNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR
　　 提出頸動(dòng)脈斑塊及人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中總的MicroRNAs，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-124在兩組斑塊中及主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞不同干預(yù)組中的相對(duì)表達(dá)量。
　　 (6)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)
　　 原代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)Sciencell，應(yīng)用VSMC培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)至80-90％融合后

43、，傳代再培養(yǎng)。第4-8代平滑肌細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。
　　 (7)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染與刺激
　　 ①miRNAs轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
　　 應(yīng)用脂質(zhì)體2000進(jìn)行miRNA(miR-con、miR-124mimics或miR-124inhibitor)轉(zhuǎn)染。具體步驟按GenePORTER2的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h，更換為常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，進(jìn)行

44、下一步檢測(cè)。
　　 ②TNFa刺激人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
　　 六孔板中平滑肌細(xì)胞的密度達(dá)到80％-90％時(shí)，按100ng/mlTNFa的劑量濃度，將TNFa加入到細(xì)胞培養(yǎng)基刺激平滑肌細(xì)胞，37℃，5％CO2溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 (8)生物信息軟件分析
　　 應(yīng)用miRanda，TargetScan，RNAhybridandPicTar等著名的MicroRNA分析預(yù)測(cè)軟件，確定P4Hα1

45、是miR-124用的靶基因。并且miR-124是調(diào)控P4Hα1的MicroRNA分子之一。進(jìn)一步確定miR-124與P4Hα13'非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3'-UTR)特異結(jié)合的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。
　　 (9)免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)
　　 同論文一
　　 (10)細(xì)胞免疫熒光
　　 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞干預(yù)后，4％甲醛固定，PBS漂洗，常規(guī)行5％兔血清封閉，分別行抗P4Ha1的一抗及帶熒光標(biāo)記的二抗孵育（避光

46、），DAPI染核后，避光拍照，使用Image-ProPlus6.0圖像分析特異熒光的表達(dá)含量。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1、P4Hα1在斑塊中的表達(dá)
　　 P4Hα1在應(yīng)激組斑塊中的蛋白表達(dá)顯著低于非應(yīng)激組（P＜0.05）。
　　 3.2、miR-124在斑塊中的表達(dá)
　　 miR-124在應(yīng)激組斑塊中的表達(dá)顯著高于非應(yīng)激組(P＜0.05)。
　　 3.3、P4Hα1在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

47、中的表達(dá)
　　 P4Hα1在TNFa刺激組中的蛋白表達(dá)顯著低于無(wú)TNFa刺激組(P＜0.05)。
　　 3.4、miR-124在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)
　　 qRT-PCR顯示，miR-124在TNFa刺激的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)是無(wú)TNFa刺激組的2.57倍（U6標(biāo)準(zhǔn)化后）。兩組間的差異有顯著性（P＜0.05）。
　　 3.5、生物信息軟件分析結(jié)果
　　 P4Hα1(NM_000917)

48、是miR-124的理論靶基因，并且結(jié)合能低。miR-124與P4Hα1的結(jié)合位點(diǎn)位于P4Hα1基因的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）的第834-841個(gè)堿基。此堿基序列位點(diǎn)在生物界的各物種之間有高度保守性。
　　 3.6、miR-124對(duì)P4Hα1表達(dá)的影響
　　 miR-124mimics轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞48小時(shí)后，P4Hα1的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染前顯著降低(P＜0.05)。miR-124inhibitors轉(zhuǎn)染人主動(dòng)

49、脈平滑肌細(xì)胞后，TNFa再刺激主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞24小時(shí)后的P4Hα1的蛋白表達(dá)量較無(wú)miR-124inhibitors預(yù)轉(zhuǎn)染組上調(diào)(P＜0.05)。
　　 3.7、miR-124通過(guò)與P4Hα1的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）的結(jié)合位點(diǎn)的特異結(jié)合作用
　　 miR-124mimics與含有野生型P4Hα1基因的3'端非編碼區(qū)序列P4Hα13'-UTR(P4Hα1-WT)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞48小時(shí)

50、后，熒光素?zé)晒獗磉_(dá)顯著地被抑制（P＜0.05）。
　　 3.8、miR-124對(duì)膠原的合成與成熟的影響
　　 miR-124mimics轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞48小時(shí)后，膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染前顯著減少（P＜0.05）。miR-124inhibitors預(yù)轉(zhuǎn)染能使TNFa誘導(dǎo)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞降低膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的作用部分地消失，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 4.結(jié)論
　　 (1)在應(yīng)激