高密度脂蛋白對動脈粥樣硬化抵抗作用及其機制.pdf

1、血脂代謝紊亂是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)最重要的危險因素之一。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)升高可以顯著增加冠心病的發(fā)病率和死亡率，而高密度脂蛋白(High-densitylipoprotein，HDL)具有抵制人類動脈粥樣硬化發(fā)生的作用。因此，深入研究HDL對動脈粥樣硬化發(fā)生的抵制作用及其機制具有重要的理論意義和臨床實用價值。
　　快速、高效建立AS模型是實現(xiàn)人類

2、AS疾病深入研究的基礎，大鼠系哺乳動物，與人類有很多相似之處，易獲得，成本低，成功建立大鼠AS模型非常重要。但是，由于大鼠自身具有抗動脈粥樣硬化作用，所以，優(yōu)化大鼠AS模型方法，是完成本課題的關鍵。本研究通過改良高脂喂養(yǎng)配方，改用人冠狀動脈交換球囊有效損傷大鼠胸腹主動脈，同時給與維生素D3(VitD3)肌注進行鈣超載干預，在最短時間內(nèi)成功創(chuàng)建了高脂血癥模型和典型的主動脈AS模型，同時伴有大鼠脂肪性肝病，腎病及肺炎改變。
　　本研究

3、又利用大鼠天然高血清HDL和極低LDL水平的血脂條件進行整體實驗，經(jīng)過隨機分組，觀察單純高脂喂養(yǎng)造模，單純球囊損傷造模和以及二者聯(lián)合造模對AS形成的影響，結果發(fā)現(xiàn)：大鼠先天高HDL水平在一定時限內(nèi)能抵御高LDL水平的致AS作用；HDL具有促進受損血管局部三磷酸腺苷結合盒轉運子(ATP binding cassette transporte A1，ABCA1)表達和促進斑塊內(nèi)膽固醇逆轉運作用，損傷及高脂干預后受損血管內(nèi)膜單核細胞趨化因子-

4、1(monocytechemoattractant protein-1，MCP-1)、血管間粘附分子-1(Vascular cell adhesionmolecule-1，VCAM-1)表達明顯增強。
　　載脂蛋白-I(Apolipoprotein A-I，ApoA-I)是HDL的主要成分，本實驗利用佛波酯(Phorbol12-myristate13-acetate，PMA)和氧化型低密度脂蛋白(Oxidative-lowdens

5、ity lipoprotein，ox-LDL)干預人急性單核細胞白血病細胞株(THP-1)并成功誘導其分化為泡沫細胞，體外實驗發(fā)現(xiàn)：ApoA-I促進泡沫細胞膽固醇流出和ABCA1蛋白的表達，呈時間和劑量依賴關系，而且ApoA-I具有降低泡沫細胞MCP-1、VCAM-1表達的作用。ApoA-I抗炎作用可能與ABCA1的作用相關。
　　第一部分大鼠高脂血癥模型建立和動脈粥樣硬化模型創(chuàng)建方法優(yōu)化
　　目的：探索成功快速建立大鼠高脂

6、血癥模型和AS模型的更好方法
　　方法：1.優(yōu)化高脂飼料配方，選(Sprague-Dawley，SD)大鼠16只進行AS造模，高脂喂養(yǎng)7周。另選8只SD大鼠以正?；A飼料喂養(yǎng)作為對照。高脂喂養(yǎng)前，喂養(yǎng)后3和7周，分別禁食水10h，在氯胺酮(10mg/kg體重)腹腔麻醉條件下，抽取靜脈血1ml檢測血脂。2.將AS造模組16只大鼠高脂喂養(yǎng)1w后，用人經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(percutaneous transluminal coron

7、ary angioplasty，PTCA)球囊導管進行胸腹主動脈損傷，建立胸腹主動脈損傷模型。3.AS造模大鼠在高脂喂養(yǎng)前當日右下肢一次性肌注VitD360萬U/kg體重，導致大鼠鈣超載。4.取造模組術后1周胸腹主動脈做掃描電鏡和光鏡檢查，術后2周和6周取近膈段胸主動脈多聚甲醛固定，制作石蠟切片，HE染色，做組織形態(tài)學分析，同時，取術后6周造模組大鼠肝臟、肺臟和腎臟，了解脂肪沉積情況。
　　結果：1.AS造模組大鼠高脂喂養(yǎng)后，血脂

8、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均有不同程度升高，呈時間依賴性，其中以TC和LDL-C增高為著，喂養(yǎng)后7w，TC水平較喂養(yǎng)前增高10倍以上，LDL-C較喂養(yǎng)前增高達70倍。而HDL-C和甘油三酯(Triglyceride，TG)則輕度增高，高脂喂養(yǎng)后3w，HDL-C增高不明顯，7周血清HDL-C水平才明顯增高，與高脂喂養(yǎng)前相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P

9、<0.05)。2.AS造模組球囊損傷后1周，掃描電鏡觀察見大部分血管內(nèi)皮細胞損傷，內(nèi)膜被剝脫，血管基底膜膠原暴露，并可見散在血小板粘附在膠原表面。內(nèi)皮損傷從主動脈弓下1cm至腹主動脈手術切口處，長約6cm。光鏡下觀察主動脈嚴重受損，術后2周見新生內(nèi)膜纖維性斑塊形成。術后6周，見典型動脈粥樣硬化斑塊形成。3.AS造模組高脂喂養(yǎng)后7周，大鼠肝臟、肺臟和腎臟均發(fā)生肉眼可見大體形態(tài)改變，分別由紫紅色、粉紅色、褐色轉變?yōu)辄S綠色，光鏡下肺臟、肝臟和

10、腎臟均有脂肪沉積，脂肪變性和間質毛細血管淤血改變。
　　結論：1.大鼠經(jīng)改良的高脂飼料配方喂養(yǎng)7周可成功創(chuàng)建高脂血癥模型，使大鼠由以HDL-C為主的血脂成分翻轉為以LDL-C為主的血脂狀態(tài)，HDL-C/LDL-C逐漸下降，為高膽固醇血癥導致血管氧化應激損傷，啟動AS的發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造條件。2.大鼠胸腹主動脈經(jīng)高脂喂養(yǎng)，鈣超載和血管內(nèi)膜有效損傷6周，可成功建立大鼠動脈粥樣硬化模型。
　　第二部分大鼠高密度脂蛋白對動脈粥樣硬化的抵

11、抗及可能機制
　　目的：探討大鼠HDL對動脈粥樣硬化的抵抗及產(chǎn)生機制
　　方法：1.SD大鼠被隨機分為正常對照組、高脂喂養(yǎng)組(簡稱高脂組)、血管損傷組(簡稱損傷組)以及高脂喂養(yǎng)加血管損傷組(簡稱高脂損傷組)。高脂飼料喂養(yǎng)7周建立高脂血癥模型并動態(tài)監(jiān)測血脂變化。2.利用第一部分創(chuàng)建的大鼠胸腹主動脈PTCA球囊損傷方法進行血管損傷，3.術后2周、6周取胸主動脈近膈段做石蠟切片，HE染色，在Leica顯微鏡下采集圖像，做組織形態(tài)學

12、分析。同時做胸主動脈平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，a-SMA)、增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA)、ABCA1、MCP-1和VCAM-1的免疫組織化學分析。利用photoshop圖像處理系統(tǒng)，分析各組陽性表達區(qū)域顏色的灰度值，做半定量分析。
　　結果：1.高脂組高脂喂養(yǎng)后出現(xiàn)血脂成分明顯翻轉，術后2w和6w血清HDL-C/LDL-C

13、由高脂喂養(yǎng)前的5.50降至0.55及0.29，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，血清LDL-C也由高脂喂養(yǎng)前0.23±0.07mmol/L增至2.99±1.08mmol/L和16.77±2.59mmol/L(P<0.01)，HDL-C和TG呈輕度升高。損傷高脂組血脂發(fā)生類似變化，與高脂組相比無統(tǒng)計學差別。損傷組血脂與正常對照組相比無明顯變化，提示大鼠血脂的變化由高脂喂養(yǎng)導致，血管損傷未加重血脂的紊亂。2.術后2w，損傷組和損傷高脂組均可

14、見胸主動脈內(nèi)彈力板斷裂，中膜較正常對照組明顯增厚及新生內(nèi)膜形成，高脂組內(nèi)膜表面光滑，與正常對照組相比無顯著性差異。術后6w，損傷組和損傷高脂組新生內(nèi)膜增厚明顯，前者見明顯纖維斑塊形成，而后者則可見典型AS斑塊形成，二者管腔面積均縮小，但在內(nèi)膜/中膜面積百分比(％)、管腔面積狹窄率(％)之間無統(tǒng)計學差別。高脂組內(nèi)膜表面欠光滑，見炎癥細胞粘附在內(nèi)膜表面，由此提示單純高脂血癥和鈣超載可引起血管內(nèi)膜的氧化應激損傷和炎癥細胞粘附，內(nèi)皮剝脫和血管壁

15、損傷是引起血管重塑和新生內(nèi)膜形成的關鍵因素。術后6w，未見機械損傷和高脂血癥氧化應激損傷導致內(nèi)膜增生和血管重塑的協(xié)同作用。3.術后2w，高脂組內(nèi)膜、損傷組新生內(nèi)膜a-SMA和PCNA表達均較正常對照組增強，損傷高脂組新生內(nèi)膜a-SMA和PCNA表達與損傷組相比無統(tǒng)計學差異。高脂組和損傷組MCP-1，VCAM-1和ABCA1表達，均明顯高于正常對照組，均P<0.05；同時發(fā)現(xiàn)高脂損傷組MCP-1，VCAM-1和ABCA1表達顯著高于高脂組

16、和損傷組，均P<0.05；損傷組MCP-1，VCAM-1表達強于高脂組，而ABCA1表達弱于高脂組，均P<0.05。
　　結論：1.大鼠具有很高的血清HDL儲備，高脂飼料喂養(yǎng)后，盡管血清LDL-C水平很高，但HDL-C與LDL-C比率仍使大鼠動脈處于HDL保護狀態(tài)。2.高脂血癥和血管機械損傷均可促進血管炎癥發(fā)生，并且二者具有協(xié)同作用，但未發(fā)現(xiàn)在促進受損血管收縮性重塑和新生內(nèi)膜增生方面的疊加作用。3.高脂因素促進ABCA1表達明顯強

17、于機械損傷，大鼠高HDL儲備抵抗AS加重的機制可能與促進受損血管ABCA1表達，促進負脂細胞膽固醇逆轉運有關。4.高表達的ABCA1和HDL可能具有抗炎作用。
　　第三部分ox-LDL誘導THP-1巨噬細胞源泡沫細胞模型的建立
　　目的：探索THP-1巨噬細胞源泡沫細胞模型創(chuàng)建的可靠方法
　　方法：1.巨噬細胞和泡沫細胞的誘導分化：THP-1細胞株接種在含有10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中置于37℃5％C

18、O2孵箱中培養(yǎng)，倍增時間為48h，THP-1呈懸浮生長。然后，以105/ml的細胞密度接種到預置蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，用50ng/ml的佛玻脂(phorbol12-myristate lipoprotein，PMA)干預THP-1細胞48h，使其由單核細胞分化為巨噬細胞。然后，再用含氧化型低密度脂蛋白(Oxidative-low density lipoprotein，ox-LDL)(50μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液干預48h，

19、使THP-1源巨噬細胞被誘導分化為泡沫細胞。2.泡沫細胞鑒定，利用油紅“O”染色和氧化酶法細胞內(nèi)膽固醇含量的測定，進行泡沫細胞定性和定量分析。3.免疫熒光染色進行巨噬細胞、泡沫細胞ABCA1，MCP-1，VCAM-1測定。
　　結果：1.經(jīng)PMA(50ng/ml)干預THP-1細胞48h后，細胞由圓形懸浮狀聚集生長逐漸呈現(xiàn)出貼壁生長，形態(tài)變?yōu)槎嘟切位蜷L梭形，伸出偽足，當巨噬細胞再經(jīng)ox-LDL(50μg/ml)干預24-48h后，

20、細胞體積逐漸增大，形態(tài)變得更加不規(guī)則，胞漿內(nèi)可見較多脂滴顆粒，由于細胞漿內(nèi)大量脂滴，甚至，將細胞核被擠到一側，符合泡沫細胞形態(tài)特點。2.油紅“O”染色見泡沫細胞內(nèi)有大量紅色顆粒狀脂滴，ox-LDL(50μg/ml)誘導組油紅“O”染色陽性細胞數(shù)量明顯高于未誘導組p<0.05。ox-LDL誘導組，細胞內(nèi)膽固醇含量明顯高于未誘導組(423.17 mg/g蛋白±11.76mg/g蛋白vs226.70mg/g蛋白±10.36 mg/g蛋白，p<

21、0.05)。膽固醇脂也顯著高于未誘導組(254mg/g蛋白±16.08 mg/g蛋白vs84.86mg/g蛋白±6.23mg/g蛋白，p<0.05)，誘導組細胞內(nèi)膽固醇脂與膽固醇比值達60％以上，提示泡沫細胞形成。3.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞經(jīng)ox-LDL誘導48h之后，細胞內(nèi)ABCA1表達較未誘導組明顯增多，而且炎癥因子MCP-1和VCAM-1表達也呈現(xiàn)明顯增多，由此提示THP-1源巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎螅毎ど螦BCA1的表達

22、明顯增強，同時刺激泡沫細胞發(fā)生氧化應激反應，合成炎癥因子MCP-1和VCAM-1增多。
　　結論：1.50ng/ml PMA干預THP-1細胞48h，可使單核細胞誘導分化為巨噬細胞。2.50μg/ml ox-LDL干預巨噬細胞48h，使巨噬細胞負脂并成功分化為泡沫細胞。3.負脂的泡沫細胞促進了ABCA1的表達，并促進細胞內(nèi)炎癥因子MCP-1和VCAM-1的表達。
　　第四部分載脂蛋白A I對泡沫細胞膽固醇流出及MCP-1、V

23、CAM-1、ABCA1表達的影響
　　目的：探索HDL核心成分ApoAI對泡沫細胞膽固醇流出的影響以及是否對炎癥因子MCP-1、VCAM-1表達產(chǎn)生影響，從而發(fā)揮抗炎作用
　　方法：以PMA(50ng/ml)及ox-LDL(50μg/ml)誘導人THP-1使其分化為負脂的泡沫細胞。以不同濃度apoA-I(5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml)孵育泡沫細胞24 h，以及apoA-I(10μg/ml)孵育

24、泡沫細胞6 h、12 h、24 h；采用油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴的變化，用氧化酶法檢測細胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯的含量；以apoA-I(10μg/ml)或ABCA1抗體(10μg/ml)孵育泡沫細胞24h，用免疫熒光法檢測巨噬細胞及經(jīng)apoA-I及ABCA1抗體干預前后的泡沫細胞MCP-1、VCAM-1及ABCA1的表達。
　　結果1.THP-1經(jīng)PMA和ox-LDL分別干預48小時后可以成功地被誘導為富含脂質的泡沫細胞

25、。2.apoA-I可促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇流出，減少細胞內(nèi)膽固醇含量，呈濃度依賴性和時間依賴性。3.隨著apoA I于預濃度增加，THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達變化不顯著，但蛋白表達增加，0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml apoA I干預濃度下油紅O染色陽性細胞率分別為(55±4)％與(43±9)％、(33±4)％、(28±1)％、(26±2)％。

26、4.ABCA1抗體干預可以增加THP-1巨噬細胞源泡沫細胞ABCA1蛋白的表達5.經(jīng)ox-LDL(50μg/ml)干預后，與巨噬細胞相比，泡沫細胞內(nèi)MCP-1、VCAM-1及ABCA1表達均明顯增強；經(jīng)apoA I(10μg/ml)干預后，與未干預組相比泡沫細胞內(nèi)MCP-1及VCAM-1表達顯著減少(P均<0.05)，而ABCA1表達明顯增加(P<0.05)；經(jīng)ABCAl抗體(10μg/ml)干預后，與未干預組相比，泡沫細胞內(nèi)MCP-1