羅格列酮在動(dòng)脈粥樣硬化模型中改善高密度脂蛋白功能的研究.pdf

1、一.研究背景
　　 冠心病(CAD)是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一,在我國(guó),隨著人民生活水平的提高,CAD的發(fā)病率亦在逐年升高。傳統(tǒng)資料表明,低水平的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)是CAD的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素,HDL-C水平與CAD的發(fā)生率及死亡率呈負(fù)相關(guān),但近年來研究發(fā)現(xiàn)HDL-C水平高低并不準(zhǔn)確代表高密度脂蛋白(HDL)的整體功能。
　　 HDL具有多種抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)功能,國(guó)際上將具有正常HDL功能的HDL

2、稱之為功能HDL(Functional HDL):包括逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)、抗炎抗氧化、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)及抗血栓及促纖溶等。HDL的血管保護(hù)作用在很大程度上是由于其介導(dǎo)了RCT,即HDL,將膽固醇從周圍組織(包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊)轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行再循環(huán)或以膽酸的形式排泄的過程。RCT過程中,其中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子Al(ABCAl)、清道夫受體BI(SR-BI)及載脂蛋白Al(Apo-Al)對(duì)其介導(dǎo)起到了關(guān)鍵的作用。抗氧化是HDL的另

3、一個(gè)重要功能。在基礎(chǔ)狀態(tài)下HDL可抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化磷脂生成,并將已生成的氧化磷脂滅活。目前認(rèn)為,與HDL抗氧化功能相關(guān)的酶最為重要并有代表意義的為屏氧酶1(PON1),其次還有Apo-Al、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)和血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)等。已有資料顯示HDL其中的抗氧化酶——PON1與抗氧化、CAD密切相關(guān),不僅CAD組PON1活性及濃度明顯高于正常對(duì)照組,而且其活性及濃度還與冠脈病變嚴(yán)重程度

4、呈負(fù)相關(guān)。
　　 但是,在多種因素所致的慢性炎癥及急性期反應(yīng)的狀態(tài)下,HDL的正常功能會(huì)發(fā)生缺失,甚至表現(xiàn)出與其正常功能相反的作用,主要表現(xiàn)為促炎、促氧化和抑制RCT等促AS作用,即成為“失功能HDL(Dysfunctional HDL)”。HDL作為多功能的蛋白復(fù)合體,其蛋白的修飾直接關(guān)系到HDL顆粒的整體功能。多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)髓過氧化物酶(MPO)參與了動(dòng)脈壁脂蛋白氧化修飾過程,研究人員從人的AS斑塊處提取出了具有酶活性MPO,

5、并且發(fā)現(xiàn)其與病變處的HDL有關(guān)。MPO選擇性氧化修飾Apo-AI,導(dǎo)致酪氨酸殘基硝化和氯化,同時(shí)減少ABCA1依賴的膽固醇外流。因此,目前認(rèn)為MPO是失功能HDL發(fā)生的可能原因之一。
　　 噻唑烷二酮類藥物(TZDs),如羅格列酮,是過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)主要的合成激動(dòng)劑,也是口服降糖藥之一。近來有研究發(fā)現(xiàn),TZDs除了降血糖效果優(yōu)于磺脲類等降糖藥外,還能直接影響血管細(xì)胞,通過抑制多種炎癥因子(如C-反應(yīng)蛋白、

6、白介素2、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等)、調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑,抑制平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞的增殖和遷移,降低炎癥反應(yīng),還能通過誘導(dǎo)與HDL代謝相關(guān)基因SR-B1、ABCA1、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子G1(ABCG1)的表達(dá)來促進(jìn)巨噬細(xì)胞-泡沫細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的平衡,抑制AS發(fā)生。但有關(guān)羅格列酮在AS模型中對(duì)與HDL功能相關(guān)的PON1活性、MPO活性及主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞上ABCA1、SR-B1的

7、影響,國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此,我們通過建立AS兔模型,研究羅格列酮對(duì)改善HDL功能的影響及其機(jī)制。
　　 二.研究目的
　　 我們以動(dòng)脈粥樣硬化(AS)兔模型為研究對(duì)象,觀察肝細(xì)胞、主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞ABCA1、SR-BI表達(dá)和HDL抗炎抗氧化功能的改變?cè)贏S形成中的作用,同時(shí)分析在AS狀態(tài)下羅格列酮對(duì)上述指標(biāo)的影響,從而探討羅格列酮通過何種機(jī)制改善HDL功能發(fā)揮抗AS作用。
　　 三.研究方法
　　 1、實(shí)

8、驗(yàn)分組
　　 18只新西蘭健康雄性大白兔(體重2.0±0.11Kg,合格證號(hào):scxk粵2006-0015)隨機(jī)分為:(1)正常對(duì)照組(n=6):給予普通飲食喂養(yǎng)；(2)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)組(n=6):予以高脂飼料；(3)羅格列酮組(n=6):在飼以高脂飲食基礎(chǔ)上給予羅格列酮[0.5 mg/(kg·d)]。
　　 2、血脂檢測(cè)
　　 分別于實(shí)驗(yàn)第0周和第12周取血清,采用酶法在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定總膽固醇(T

9、C)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平(單位mmol/L)。
　　 3、HDL抗炎抗氧化功能的檢測(cè)
　　 收集實(shí)驗(yàn)第12周的血清標(biāo)本,采用乙酸苯酯法測(cè)定屏氧酶1(PON1)活性；髓過氧化物酶(MPO)活性用MPO試劑盒在分光光度計(jì)上測(cè)定。
　　 4、肝細(xì)胞及主動(dòng)脈壁斑塊內(nèi)細(xì)胞上的HDL受體ABCA1及SR-B1的檢測(cè)
　　 (1)肝組織總RNA的提取

10、用Trizol提取法,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTQ-PCR)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)肝細(xì)胞ABCA1及SR-BI mRNA的表達(dá)量。
　　 (2)免疫組化法標(biāo)記主動(dòng)脈ABCA1及SR—BI受體表達(dá)情況,使用Image proplus6.0圖片分析軟件分析主動(dòng)脈壁斑塊內(nèi)細(xì)胞上ABCA1或SR-B1的蛋白表達(dá)情況:包括其表達(dá)平均光密度值和其表達(dá)面積百分比。
　　 5、病理組織學(xué)觀察主動(dòng)脈斑塊形成情況
　　 實(shí)驗(yàn)第12周收集主動(dòng)

11、脈標(biāo)本,10％中性甲醛固定液固定,常規(guī)制組織石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察其組織病理改變,并測(cè)量其內(nèi)中膜厚度(IMT)及動(dòng)脈斑塊/血管面積比。
　　 6、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,并采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)12周三組兔血脂情況比較采用協(xié)方差分析,組間兩兩比較采用LSD法；實(shí)驗(yàn)開始時(shí)三組兔血脂情況、實(shí)驗(yàn)12周三組兔血清PON1和MPO活性變化、實(shí)

12、驗(yàn)12周三組兔肝組織ABCA1和SR-B1 mRNA的表達(dá)、實(shí)驗(yàn)12周三組兔主動(dòng)脈IMT比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差不齊時(shí)用Welch校正檢驗(yàn),多重比較方差齊性時(shí)采用LSD法檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Dunnett'sT3法檢驗(yàn)。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),各組實(shí)驗(yàn)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),各組測(cè)得的血清PON1活性及MPO活性分別與主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度進(jìn)行兩變量間的Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有顯著

13、性。
　　 四.研究結(jié)果
　　 1、入組前各組動(dòng)物間血清總膽固醇(TC)(P=0.525,F=0.672)、甘油三酯(TG)(P=0.665,F=0.420)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(P=0.978,F=0.023)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)(P=0.505,F=0.614)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(P=0.982,F=0.018)、非高密度脂蛋白膽固醇(NHDL-C)(P=0.473,F

14、=0.788)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,入選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基線統(tǒng)一。12周后,各組進(jìn)行組間比較實(shí)驗(yàn):與正常對(duì)照組相比,AS組血清TC(23.26±3.30 vs1.79±0.21,P=0.000)、TG(1.58±0.25 vs1.02±0.15,P=0.000)、LDL-C(18.09±4.04 vs1.09±0.23,P=0.000)、VLDL-C(4.06±1.42 vs0.25±0.14,P=0.000)、HDL-C(1.11±0.09 v

15、s0.45±0.12,P=0.000)、NHDL-C(22.15±3.22 vs1.34±0.10,P=0.000)水平顯著升高,其差異有統(tǒng)計(jì)意義:與AS組相比,羅格列酮組血清HDL-C(1.94±0.30 vs1.11±0.09,P=0.000)水平顯著升高,TC(19.78～1.68 vs23.26±3.30,P=0.010)、VLDL-C(2.28±1.03 vs4.06±1.42,P=0.008)、NHDL-C(17.51±1.

16、43 vs22.15±3.22,P=0.002)顯著降低,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但血清LDL-C(15.57±1.81 vs18.09±4.04,P=0.118)水平無顯著改變。
　　 3組兔血脂各項(xiàng)指標(biāo)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)前后(0周/12周)比較:正常對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)前后血清TC(1.85±0.12 vs1.79±0.21,t=0.538,P=0.614)、TG(1.04±0.19 vs1.02±0.15,t=0.162,P=0

17、.878)、LDL-C(1.00±0.20 vs1.09±0.23,t=0.566,P=0.596)、VLDL-C(0.38±0.10 vs0.25±0.14,t=1.485,P=0.198)、HDL-C(0.47±0.12 vs0.45±0.12,t=0.369,P=0.727)、NHDL-C(1.38±0.14 vs1.34±0.10,t=0.475,P=0.655)無顯著改變。AS組高脂飼料干預(yù)前后血清TC(1.77±0.15 v

18、s23.26±3.30,t=-16.603,P=0.000)、TG(1.10±0.14 vs1.58±0.25,t=-4.498,P=0.006)、LDL-C(1.00±0.20 vs18.09±4.04,t=-10.251,P=0.000)、VLDL-C(0.30±0.11 vs4.06±1.42,t=-6.061,P=-0.002)、HDL-C(0.48±0.12 vs1.11±0.09,t=-14.615,P=0.000)、NHD

19、L-C(1.29±0.14 vs22.15±3.22,t=-16.045,P=-0.000)顯著升高。羅格列酮組干預(yù)前后血清TC(1.78±0.12 vs19.78±1.68,t=-25.288,P=0.000)、TG(1.02±0.14 vs1.54±0.15,t=-5.184,P=0.004)、LDL-C(0.98±0.14 vs15.57±1.81,t=-20.228,P=0.000)、VLDL-C(0.34±0.20 vs2.2

20、8±1.03,t=-4.247,P=0.008)、HDL-C(0.47±0.07 vs1.94±0.30,t=-10.561,P=0.000)、NHDL-C(1.32±0.11 vs17.51±1.43,t=-26.067,P=0.000)顯著升高。
　　 2、實(shí)驗(yàn)12周后,3組兔血清屏氧酶1(PON1)活性變化:與正常對(duì)照組比較,AS組血清PON1活性[(72.26±12.03)U/ml vs(96.77±5.58)U/ml,

21、P=0.000]顯著降低,而羅格列酮組[(105.18±8.49)U/ml vs(72.26±12.03)U/ml,P=0.000]較AS組顯著升高。
　　 3、實(shí)驗(yàn)12周后,3組兔血清髓過氧化物酶(MPO)活性變化:與正常對(duì)照組(14.94±6.36)U/L比較,AS組血清MPO活性[(85.67±17.92)U/L vs(14.94±6.36)U/L,P=0.000]顯著升高,而羅格列酮組[(54.45±10.99)U/L

22、vs(85.67±17.92)U/L,P=0.018]較AS組顯著降低。
　　 4、實(shí)驗(yàn)12周后,3組兔肝細(xì)胞ABCAl及SR-B1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況(用2-△△CT表示):與正常對(duì)照組相比,AS組ABCAl mRNA(0.61±0.12 vs1.00±0.03,P=0.001)和SR-BI mRNA(0.63±0.11 vs1.00±0.02,P=0.001)表達(dá)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)意義；與AS組相比,羅格列酮組ABCA

23、l mRNA(1.29±0.27 vs0.61±0.11,P=0.003)和SR-BI mRNA(0.63±0.11 vs1.39±0.23,P=0.000)表達(dá)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 5、實(shí)驗(yàn)12周后,HE染色觀察3組兔主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT)及斑塊面積的組織病理學(xué)特點(diǎn):電子顯微鏡下觀察各組主動(dòng)脈見正常對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑,連續(xù),內(nèi)皮細(xì)胞完整；AS組血管內(nèi)膜明顯增厚,血管腔明顯縮??；與正常對(duì)照組比較,AS組主動(dòng)脈內(nèi)

24、中膜增厚(527.42±85.16μm vs203.21±30.61μm,P=0.000),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AS組比較,羅格列酮組主動(dòng)脈內(nèi)中膜(291.46±50.18μm vs527.42±85.16μm,P=0.000)、斑塊/血管內(nèi)膜表面積百分比顯著減小(5.88±3.31％vs27.78±12.00％,t=4.304,P=0.002),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、實(shí)驗(yàn)12周后,免疫組化染色觀察主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞上A

25、BCAl及SR-B1表達(dá)情況并用Image-plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析:與AS組比較,羅格列酮組的主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞上ABCAl表達(dá)平均光密度值(0.22±0.03 vs0.17±0.03,t=-2.661,P=0.024)及ABCAl表達(dá)面積百分比(％)(47.06±4.93 vs24.13±9.85,t=-5.100,P=0.000)明顯增加；其主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞上SR-B1表達(dá)平均光密度值(0.20±0.03 vs0.18±0

26、.03,t=-0.756,P=0.467)及SR-BI表達(dá)面積百分比(％)(24.74±13.04 vs18.81±7.58,t=-0.964,P=0.358)亦增加,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 7、血清PON1活性與主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(r=-0.675,P=0.002)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,血清MPO活性與主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(r=0.774,P=0.000)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。
　　 五.結(jié)論
　　 1、羅格列酮降低AS

27、兔血清TC、VLDL-C及NHDL-C水平,升高血清HDL-C水平。
　　 2、羅格列酮通過上調(diào)AS兔主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞上ABCAl的表達(dá)及肝細(xì)胞上ABCA1、SR-B1的表達(dá),促進(jìn)HDL,逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)作用。
　　 3、羅格列酮通過增加PON1活性,降低MPO活性以增強(qiáng)AS兔的HDL,抗氧化、抗炎功能。
　　 4、羅格列酮明顯減輕AS狀態(tài)下的主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT)及斑塊/血管內(nèi)膜表面積百分比,發(fā)揮減輕