miR-196b-5p對脂肪細胞分化的調控.pdf

1、背景和目的：隨著人類生活水平的日益提高，肥胖的發(fā)病率逐年升高，肥胖可以引起胰島素抵抗、糖尿病、癌癥、骨質疏松等，因此，對于肥胖我們需要積極預防和治療。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)，越來越多的的研究證明miRNA對脂肪細胞的分化具有一定影響。本研究以 miR-196b-5p為對象探討其對脂肪細胞分化的作用，預測并鑒定其靶基因，初步探討miR-196b-5p影響脂肪細胞分化的機制。
　　方法：1.對骨髓基質細胞系ST2進行脂肪細胞誘導分化，并

2、利用 RT-qPCR檢測細胞分化過程中 miR-196b-5p的表達變化。對ST2細胞轉染 miR-196b-5p mimics及miR-196b-5p inhibitor并對細胞進行成脂誘導，利用 RT-qPCR、Western Blotting和油紅O染色等技術觀察miR-196b-5p對ST2細胞成脂分化的影響。2.利用靶基因預測軟件對miR-196b-5p的靶基因進行預測，構建表達靶基因3′UTR的熒光素酶報告基因載體，利用熒光

3、素酶報告基因技術鑒定靶基因。探討miR-196b-5p調節(jié)脂肪細胞分化的分子機制。
　　結果：1. miR-196b-5p在ST2細胞誘導成脂后表達上升，提示miR-196b-5p可能參與調控脂肪細胞分化。2.轉染miR-196b-5p mimics后，ST2細胞成脂特異性基因 PPARγ、C/EBPα、aP2和 adipsin的表達均上調，細胞分化成熟。而轉染miR-196b-5p inhibitor則與上述結果相反，表明miR

4、-196b-5p促進了脂肪細胞分化。3.生物信息學預測Tgfbr1、Nr2c2、Rbpj、Foxo1、Sema3a為miR-196b-5p的潛在靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測顯示， miR-196b-5p mimics與Tgfbr1、Foxo13′UTR熒光素酶報告基因質粒共轉染AD293細胞后熒光素酶活性顯著下降，但 miR-196b-5p mimics不能降低 Nr2c2、Rbpj、Sema3a3′UTR載體的熒光素酶活性。隨后我們

5、構建了 Tgfbr1、Foxo13′UTR應答序列的缺失突變體，將此突變體或其野生型質粒與 miR-196b-5p mimics共轉染后，雙熒光素酶報告基因活性檢測結果顯示miR-196b-5p mimics不能抑制突變體熒光素酶活性，證實Tgfbr1、Foxo1是miR-196b-5p的靶基因。本研究證實miR-196b-5p促進骨髓基質細胞的成脂分化，其作用機制可能是通過靶向結合 Tgfbr1、Foxo1的3′UTR而阻斷其翻譯實現(xiàn)