miR-224、miR-146b、miR-215和miR-135a對脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的作用研究.pdf

1、近年來，大量的研究表明miRNA在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝方面起著重要的調(diào)控作用，miRNA通過靶向脂肪生成的重要轉(zhuǎn)錄因子和脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝。本論文基于5月齡大白豬和梅山豬的背部脂肪組織Solexa測序獲得的差異表達(dá)的miRNAs，通過對miRNAs的序列分析、靶基因預(yù)測和功能分析等，靶定miR-224、miR-146b、miR-215和miR-135a。采用雙熒素酶報(bào)告基因檢測、Q-PCR、Westernblo

2、tting等方法對4個(gè)miRNAs的作用和功能進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)果如下:
　　1.miR-224調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝
　　經(jīng)UCSC網(wǎng)站比對發(fā)現(xiàn)，包括豬在內(nèi)的多種哺乳動物的miR-224定位在X染色體上的相同的位置，即GABRE基因的內(nèi)含子處;通過對miR-224的前體序列和成熟序列進(jìn)行比對，它們在哺乳動物中的序列高度保守。
　　通過多種靶基因預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，EGR2和ACSL4可能是miR-224的靶基

3、因。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)，與對照組相比，miR-224-5p明顯抑制了EGR2-3'UTR和ACSL4-3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光活性。
　　在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中miR-224-5p表達(dá)量先下降后上升。miR-224-5p轉(zhuǎn)染組經(jīng)誘導(dǎo)分化甘油三脂含量明顯低于對照組，同時(shí)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、aP2的表達(dá)量也明顯下降。
　　miR-224-5p在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化早期通過直接靶向EGR

4、2，抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游的C/EBPβ基因的表達(dá);抑制表達(dá)的EGR2基因至少是部分通過抑制C/EBPβ的表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、aP2的表達(dá)，導(dǎo)致甘油三脂積累受阻，從而抑制脂肪細(xì)胞分化。
　　在脂肪分化晚期，miR-224-5p直接靶向ACSL4，抑制ACSL4的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而抑制脂肪酸β氧化過程中脂肪酸的活化，致使脂肪酸β氧化過程受阻，從而調(diào)控脂肪酸代謝。
　　本研究首次證實(shí)了miR-2

5、24通過靶向EGR2和ACSL4在脂肪生成的不同時(shí)期發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。
　　2.miR-146b調(diào)控脂肪細(xì)胞分化
　　miR-146b序列比對發(fā)現(xiàn)，miR-146b的成熟序列有很高的保守性。通過多種靶基因預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Runx1t1和Smad4可能是miR-146b的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)，與對照組相比，miR-146-5p明顯抑制了Runx1t1-3'UTR和Smad4-3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光

6、活性。
　　miR-146b-5p轉(zhuǎn)染組經(jīng)誘導(dǎo)分化后甘油三脂含量明顯高于對照組，同時(shí)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因C/EBPα、PPARγ、aP2的mRNA和蛋白表達(dá)量也明顯上升。
　　miR-146b-5p在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化早期靶向Runx1t1，抑制其表達(dá)，可能通過影響Runx1t1與C/EBPβ的相互作用從而調(diào)控C/EBPα啟動子的活性促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化;miR-146b-5p還能夠靶向Smad4，抑制其表達(dá)，至少是部

7、分通過抑制TGFβ通路下游基因CTGF的表達(dá)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。
　　3.miR-215調(diào)控脂肪細(xì)胞分化
　　miR-215序列比對發(fā)現(xiàn)，miR-215的成熟序列有很高的保守性。通過多種靶基因預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC3B和CTNNBIP1可能是miR-215的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)，與對照組相比，miR-215-5p明顯抑制了FNDC3B-3'UTR和CTNNBIP1-3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光活性。

8、>　　miR-215-5p轉(zhuǎn)染組經(jīng)誘導(dǎo)分化甘油三脂含量明顯低于對照組，同時(shí)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因C/EBPa、PPARγ、aP2的mRNA和蛋白表達(dá)量也明顯降低。
　　miR-215-5p在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化早期靶向FNDC3B，抑制其表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化;miR-215-5p還能夠靶向CTNNBIP1，抑制其表達(dá)，通過促進(jìn)Wnt通路下游基因c-myc和CCND1的表達(dá)抑制脂肪的分化。
　　4.miR-135a

9、調(diào)控脂肪酸碳鏈的延長
　　miR-135a序列比對發(fā)現(xiàn)，miR-135a的成熟序列有很高的保守性。通過多種靶基因預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ELOVL2和ELOVL6可能是miR-135a的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)，與對照組相比，miR-135a-5p明顯抑制了ELOVL2和ELOVL6雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光活性。
　　Q-PCR檢測顯示:在小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞中，miR-135a-5p抑制了ELOVL6的表達(dá);而在小鼠H

10、epa1-6肝臟細(xì)胞中，ELOVL2和ELOVL6的表達(dá)都被miR-135a-5p的超表達(dá)所抑制。miR-135a可能參與調(diào)控脂肪酸碳鏈的延長。
　　綜上所述，本研究的結(jié)論是:①miR-224在脂肪細(xì)胞分化早期通過靶向EGR2抑制脂肪細(xì)胞的分化，在脂肪細(xì)胞分化晚期通過靶向ACSL4調(diào)控脂肪酸代謝;②miR-146b在脂肪細(xì)胞分化早期通過靶向Runx1t1和Smad4促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化;③miR-215在脂肪細(xì)胞分化早期通過靶向FND