血管內皮細胞miR-125和miR-126的功能研究.pdf

1、血管內皮細胞既是循環(huán)和組織器官間的第一道屏障，也是許多心血管活性物質的主要來源，直接參與了心血管活動的調節(jié)，其功能是維持循環(huán)系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定的基礎。內皮細胞的功能調節(jié)又有賴于一系列心血管活性物質，如血管內皮生長因子、內皮素、一氧化氮和血管緊張素Ⅱ等等。近年來研究發(fā)現的一種小分子調節(jié)物質microRNA，能夠通過調控這些與內皮細胞功能密切相關的基因的表達而參與內皮細胞和血管功能的調節(jié)。尤其是一些血管內皮細胞特異性和高表達的microRNA，

2、在血管的生理和病理生理過程中發(fā)揮著重要的調控功能。miR-125和miR-126是目前報道的與血管內皮細胞及血管功能密切相關的microRNA。研究表明，miR-125家族的兩個成員：miR-125a和miR-125b在球囊損傷內皮引起內膜增生的血管中表達顯著下降；而在單核巨噬細胞中，miR-125a能夠為氧化低密度脂蛋白刺激所誘導表達增加，并能抑制單核巨噬細胞對脂質的攝取以及炎癥因子的分泌，提示miR-125a/b參與了動脈粥樣硬化疾

3、病的血管炎癥反應和血管內皮損傷及內膜增生等血管病理過程。miR-126是一種血管內皮細胞特異性表達的microRNA，它能夠通過調控Spred-1、VCAM-1、HoxA9、v-Crk、EGFL-7和VEGF等基因的表達參與調節(jié)血管發(fā)育、新生血管形成以及血管炎癥反應等血管的生理和病理生理過程。
　　 方法：
　　 一、MicroRNA-125a/b抑制血管內皮細胞內皮素-1基因表達及機制
　　 1、利用micro

4、RNA定量PCR技術檢測miR-125a和miR-125b在小鼠不同組織和細胞的表達分布，同時利用Western blot檢測ET-1基因初級翻譯產物：前內皮素原(ppET-1)在這些組織細胞中的表達。
　　 2、在H5V血管內皮細胞內轉染pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b分別過表達miR-125a和miR-125b，Western Blot檢測前內皮素原(ppET-1)的表達；利用miR-125a

5、inhibitor和miR-125b inhibitor在血管內皮細胞分別下調miR-125a和miR-125b后，檢測ppET-1表達，研究miR-125a/b對血管內皮細胞ppET-1表達的影響。
　　 3、構建攜載ET-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的pGL3重組螢光素酶報告基因質粒，分別與pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b共轉染293A細胞，檢測螢光素酶的活性；明確miR-125a和miR-125

6、b調控ET-1基因表達的機制。
　　 4、分別利用10μg/ml氧化低密度脂蛋白刺激H5V和b.END3兩種血管內皮細胞6、12、24、36和48小時，定量PCR檢測miR-125a和miR-125b的表達變化，同時利用Western Blot檢測ppET-1的表達變化。通過轉染pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b在H5V血管內皮細胞內分別過表達miR-125a和miR-125b后，再利用10μg/ml

7、氧化低密度脂蛋白刺激上述轉染的細胞24小時，檢測細胞總蛋白中ppET-1的表達以及培養(yǎng)上清液中ET-1的含量，明確miR-125a/b對氧化低密度脂蛋白誘導血管內皮細胞ET-1表達的影響。
　　 5、檢測6周齡SHR-SP大鼠和WKY大鼠主動脈中miR-125a、miR-125b和ET-1的表達。
　　 二、血管內皮miR-126/126*通過抑制SDF-1的表達調控骨髓間充值干細胞的遷移
　　 1、利用micr

8、oRNA定量PCR方法檢測miR-126和miR-126*在小鼠不同組織和部分細胞中的表達分布；并檢測低氧培養(yǎng)和氯化鈷兩種模擬缺氧的理化刺激條件下H5V血管內皮細胞中miR-126和miR-126*的表達變化，以及小鼠急性腦缺血模型腦組織中miR-126和miR-126*的表達變化。
　　 2、在血管內皮細胞，通過轉染pSuper-miR-126同時過表達miR-126和miR-126*，隨后對血管內皮細胞進行低氧培養(yǎng)，West

9、ern blot檢測SDF-1蛋白表達變化，研究miR-126和miR-126*對低氧誘導SDF-1表達的影響；通過共轉染miR-126 inhibitor和miR-126* inhibitor同時下調miR-126和miR-126*的表達，檢測SDF-1蛋白的表達，研究在生理條件下下調血管內皮細胞miR-126和miR-126*對SDF-1表達的影響。同時利用ELISA檢測上述實驗中細胞培養(yǎng)上清液SDF-1的含量。
　　 3、

10、構建攜載SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的pGL3重組質粒，并分別對SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上預測的miR-126和miR-126*的作用靶序列進行突變，得到兩種突變型的pGL3重組質粒。通過將pSuper-miR-126、miR-126 mimic以及miR-126*mimic分別與這三種pGL3的重組質粒共轉染293A細胞，檢測共轉染后重組螢光素酶報告基因的活性，研究miR-126和miR-126*對SDF-1基因mRN

11、A3'非翻譯區(qū)上各自預測靶位點的功能作用。
　　 4、分別利用miR-126 mimic和miR-126*mimic轉染血管內皮細胞同時或單獨過表達miR-126和miR-126*，檢測SDF-1的表達變化。利用miR-126 inhibitor和miR-126*inhibitor在血管內皮細胞同時或單獨下調miR-126和miR-126*，檢測SDF-1的表達變化。研究單獨或同時過表達和下調miR-126及miR-126*對S

12、DF-1表達的影響及二者的相互關系。
　　 5、鑒于SDF-1對干細胞的趨化功能，在H5V血管內皮細胞過表達miR-126和miR-126*后對其進行低氧培養(yǎng)，利用體外Transwell遷移實驗研究miR-126和miR-126*對骨髓間充質干細胞(MSC)向缺氧血管內皮細胞遷移的影響。
　　 二、血管內皮miR-126/126*通過抑制SDF-1的表達調控骨髓間充值干細胞的遷移
　　 1、驗證了miR-126是

13、一種血管內皮細胞特異性高表達的microRNA，同時也證明miR-126*也是一種血管內皮細胞特異性高表達的microRNA；并且發(fā)現低氧培養(yǎng)和氯化鈷刺激均不影響H5V血管內皮細胞中miR-126和miR-126*的表達，而在小鼠急性腦缺血模型腦組織miR-126和miR-126*表達均下調。
　　 2、在血管內皮細胞同時過表達miR-126和miR-126*能夠顯著抑制低氧所誘導的SDF-1表達增加和分泌，而同時下調miR-1

14、26和miR-126*則能夠顯著誘導SDF-1的表達和分泌。
　　 3、利用pSuper-miR-126和miR-126/126*mimic同時和分別過表達miR-126和miR-126*均能夠抑制攜載野生型SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的螢光素酶報告基因表達，而將SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上miR-126和miR-126*的靶位點突變后，miR-126和miR-126*對重組螢光素酶報告基因的抑制作用消失。

15、　　 4、在血管內皮細胞單獨過表達miR-126和miR-126*并不能抑制低氧所誘導的SDF-1表達增加，而單獨下調miR-126和miR-126*也不能誘導SDF-1的表達，只有同時過表達或下調miR-126和miR-126*才能夠抑制或誘導SDF-1的表達；同時過表達miR-126和miR-126*對攜載野生型SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)的重組螢光素酶報告基因的抑制作用比分別單獨過表達二者更為顯著。
　　 5、在血

16、管內皮細胞利用pSuper-miR-126和miR-126/126*mimic同時過表達miR-126和miR-126*能夠顯著抑制低氧誘導的MSC向缺氧血管內皮細胞的遷移：同時下調miR-126和miR-126*則能夠誘導MSC向血管內皮細胞的遷移。
　　 結論：
　　 1、miR-125a和miR-125b均為血管內皮細胞高表達的microRNA。
　　 2、miR-125a和miR-125b能夠通過作用于E

17、T-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上特異性靶位點抑制ET-1基因的表達，并可能藉此參與ox-LDL刺激對血管內皮細胞ET-1的表達調控以及SHR-SP大鼠血壓的調節(jié)。
　　 3、miR-126和miR-126*均為血管內皮特異性高表達的microRNA。
　　 4、miR-126和miR-126*能夠作用于SDF-1基因mRNA3'非翻譯區(qū)上各自特異性靶序列抑制血管內皮細胞SDF-1的表達和分泌，二者作用具有協(xié)同效應。