miR-146b在慢性缺氧致心肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　20世紀(jì)以來(lái)，隨著篩查和治療技術(shù)的進(jìn)步，先心病的治愈率顯著提升，但是復(fù)雜型先心病死亡率仍然很高。紫紺型先心病是較為常見(jiàn)的復(fù)雜型先心病。在紫紺型先心病中，心臟血流由右向左分流導(dǎo)致的慢性缺氧是此類(lèi)先心病共有的病理生理過(guò)程。雖然紫紺型先心病的患者長(zhǎng)期處于慢性缺氧狀態(tài)，但他們大多數(shù)人能耐受這種缺氧存活，直至合適的手術(shù)時(shí)期。已有的研究證實(shí)，心肌慢性缺氧適應(yīng)性改變能增強(qiáng)心肌細(xì)胞對(duì)多種外界刺激的耐受，但這其中的機(jī)制并未完全闡明。因此

2、，研究慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞的適應(yīng)機(jī)制可能為改善臨床治療效果，降低缺氧性心臟病的死亡率做出貢獻(xiàn)。
　　MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性，短鏈單鏈非編碼RNA。miRNA基因以單拷貝，多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，miRNA與靶mRNA配對(duì),通過(guò)形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(miRISC),抑制mRNA翻譯或加速mRNA降解，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNA被證實(shí)在心臟發(fā)育以及疾病的病理進(jìn)程中都發(fā)揮重要作用。例如，mi

3、R-1促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，而miR-133抑制胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。敲除miR-21促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，而過(guò)表達(dá)miR-21心肌肥厚反應(yīng)減弱。過(guò)表達(dá)miR-208a將導(dǎo)致心肌肥厚和心律失常。查閱法洛氏四聯(lián)癥miR-array表達(dá)譜差異的文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)miR-146b在法洛氏四聯(lián)癥高表達(dá)。以其他細(xì)胞缺氧模型為參考，miR-146b在肺上皮細(xì)胞缺氧情況下高表達(dá)。北京安貞醫(yī)院一組研究人員研究發(fā)現(xiàn)，小型豬紫紺性心臟病模型中，miR-

4、146b在肺組織中高表達(dá)。這些結(jié)果都提示miR-146b可能參與慢性缺氧心肌病理改變，其調(diào)控的方式還未見(jiàn)報(bào)道。
　　核糖核酸酶 L(ribonuclease L,RNase L)是2-5A系統(tǒng)成員，屬于MX家族。研究表明RNase L誘導(dǎo)依賴caspase級(jí)聯(lián)酶的細(xì)胞凋亡。此外，凋亡發(fā)生時(shí)，RNase L從胞漿移動(dòng)到線粒體，改變?chǔ)う稭(線粒體膜電位),產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)。敲除 R

5、Nase L后，相對(duì)于未敲除組細(xì)胞凋亡明顯減少，研究表明這部分是由JNK/c-Jun通路介導(dǎo)的。RNase L也可以通過(guò)間接影響IKK-κ和IKK-α影響NF-κB通路。Tissue-specific Gene Expression and Regulation(TiGER)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示RNase L mRNA在心臟組織中高表達(dá)，這表明它可能在心肌細(xì)胞病理生理進(jìn)程中起到重要作用。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬在體內(nèi)(臨床心肌標(biāo)本)

6、和體外(細(xì)胞)兩個(gè)水平檢測(cè)慢性缺氧條件下miR-146b的表達(dá)變化。在體外心肌細(xì)胞慢性缺氧模型中使用抑制劑改變miR-146b的表達(dá)，檢測(cè)改變miR-146b表達(dá)對(duì)缺氧H9c2心肌細(xì)胞的影響。同時(shí)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并由報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確認(rèn)miR-146b的靶基因。隨后檢測(cè)缺氧時(shí)下調(diào)miR-146b是否導(dǎo)致NF-κB和STAT3的激活。最后我們下調(diào)靶基因RNase L，研究該基因在心肌細(xì)胞慢性缺氧中可能的作用。
　　方法：
　　本

7、研究分五部分：
　　1.體內(nèi)（臨床心肌標(biāo)本）和體外（細(xì)胞）兩個(gè)水平檢測(cè)缺氧對(duì)miR-146b表達(dá)影響。
　　1.1 收集人心肌標(biāo)本，紫紺組病人患有法洛四聯(lián)癥或肺動(dòng)脈閉鎖合并室間隔缺損，非紫紺組病人患有右室流出道狹窄合并室間隔缺損)，標(biāo)本于手術(shù)中取自右室流出道。提取組織RNA，采用RT-PCR檢測(cè)miR-146b在兩組病人標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　1.2 將同一批次H9c2（大鼠心室肌細(xì)胞系）細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱(1.0％

8、O2、5.0%CO2)中分別培養(yǎng)24h、48h及72h，對(duì)照組置于普通培養(yǎng)箱(21.0% O2)中培養(yǎng)，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在心肌細(xì)胞系中隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)miR-146b表達(dá)情況。
　　2.探索miR-146b在H9c2細(xì)胞慢性缺氧中的作用及調(diào)控機(jī)制：
　　2.1 常氧時(shí)在H9c2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染帶綠色熒光的陰性對(duì)照，通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　2.2 向部分H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-146b inh

9、ibitor（后簡(jiǎn)稱146b-inh），建立常氧，慢性缺氧，慢性缺氧+轉(zhuǎn)染146b-inh,慢性缺氧+轉(zhuǎn)染146b-inh NC四個(gè)實(shí)驗(yàn)組。通過(guò)LDH細(xì)胞毒性檢測(cè),流式Annexin V-FITC/PI檢測(cè)，Hoechst染色，TUNEL染色，JC-1染色這幾種實(shí)驗(yàn)方法測(cè)量各組細(xì)胞損傷或凋亡程度，探索下調(diào)miR-146b對(duì)缺氧心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響;利用Western-Blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspse3,Bcl

10、-2和Bax在各組中的表達(dá)情況；
　　3.利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan預(yù)測(cè)miR-146b的靶基因。構(gòu)建靶基因RNase L的野生型及突變型雙熒光素酶報(bào)告基因，將miR-146b mimic或其N(xiāo)C與野生型或突變型報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后利用熒光照度計(jì)檢測(cè)報(bào)告基因相對(duì)熒光值，以此檢測(cè)miR-146b與RNase L mRNA是否能物理結(jié)合；同時(shí)采用Western-Bolt技術(shù)，在H9c2細(xì)胞系中通過(guò)轉(zhuǎn)染146b

11、-inh下調(diào)miR-146b后，檢測(cè)心肌細(xì)胞系中RNase L蛋白的表達(dá)變化。
　　4.Western-Bolt檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-146b inhibitor后缺氧情況下H9c2細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白P65及其磷酸化形式的表達(dá)變化,以及STAT3蛋白及其磷酸化形式的表達(dá)變化。
　　5.初步研究RNase L在心肌慢性缺氧中的表達(dá)及作用：
　　5.1 免疫組化檢測(cè)RNase L在人心肌組織中的表達(dá)情況。
　

12、　5.2 在前述1.2構(gòu)建的慢性缺氧心肌細(xì)胞模型中，利用RT-PCR及Western-bolt技術(shù)檢測(cè)缺氧后RNase L mRNA和蛋白的表達(dá)變化，以及RLI蛋白表達(dá)變化。
　　5.3 設(shè)計(jì)并化學(xué)合成RNase L siRNA，轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，利用RT-PCR方法檢測(cè)干擾效率，選取有效的siRNA干擾序列。
　　5.4 利用流式Annexin V-FITC/PI檢測(cè)缺氧情況下轉(zhuǎn)染RNase L siRNA對(duì)凋亡的影響；<

13、br>　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示miR-146b在紫紺型和非紫紺型先心病病人標(biāo)本表達(dá)存在顯著差異，前者是后者的1.40倍（P<0.05）。
　　2.RT-PCR結(jié)果顯示在H9c2心肌細(xì)胞中miR-146b的表達(dá)量隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，并在72h達(dá)到頂峰，達(dá)到常氧對(duì)照組的1.97倍（P<0.05）。
　　3.將inhibitor熒光陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，熒光顯微鏡觀測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)到75%以

14、上。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146b化學(xué)模擬物或抑制劑后缺氧72h，LDH細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-146b mimic可顯著減少細(xì)胞死亡（死亡率下降20.3%，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-146b inhibitor則起到相反的結(jié)果（死亡率升高64%，P<0.05)。我們接著利用流式Annexin V-FITC/PI，TUNEL染色，Hoechst染色及JC-1染色檢測(cè)缺氧心肌凋亡情況，結(jié)果顯示與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-146b

15、 inhibitor均能顯著增加細(xì)胞凋亡（所有P<0.05)。同時(shí)Western-Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-146b inhibitor后，cleaved-Caspase3、Bax的蛋白量顯著增加（分別升高73.0%和72.8%，P<0.05），而B(niǎo)cl-2的表達(dá)下降37.2%（P<0.05），Bcl-2/Bax也有明顯降低（下降64.0%，P<0.05）。
　　4.雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染mimic與野生型報(bào)告基因后可

16、顯著降低熒光強(qiáng)度（下降30.9%，P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告基因與mimic則沒(méi)有這種差異(P>0.05)。同時(shí)在H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146b inhibitor后，RNase L蛋白表達(dá)增加6.61倍（P<0.05）。
　　5. H9c2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146b抑制劑后缺氧培養(yǎng)72h，Western-Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-146b inhibitor并沒(méi)有改變p65和STAT3蛋白表達(dá)（P>0.05）,但

17、這兩個(gè)蛋白的磷酸化水平顯著增加,分別為對(duì)照組的2.2倍和1.27倍（P<0.05）。
　　6.免疫組化結(jié)果顯示在人心肌組織標(biāo)本中，RNase L高表達(dá)于心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，而較低表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞)。
　　7.利用RT-PCR和Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞缺氧后，RNase L mRNA和蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)（RNase L mRNA缺氧72h與0h相比下降61.0%，P<0.05），而它的抑制因子(R

18、LI)蛋白表達(dá)增加。
　　8.利用RT-PCR檢測(cè)沉默效率，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的3對(duì)RNase L siRNA僅1對(duì)能有效沉默靶標(biāo)基因，使RNase L mRNA水平下調(diào)52.3%（P<0.05）。在H9c2細(xì)胞中干擾RNase L表達(dá)后置于缺氧孵箱中培養(yǎng)72h，流式Annexin V-FITC/PI檢測(cè)缺氧心肌的凋亡，結(jié)果顯示RNase L siRNA轉(zhuǎn)染組中凋亡細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組(4.36%vs. NC12.4%)。
　　結(jié)論：<

19、br>　　1.在病人心肌標(biāo)本中，紫紺組miR-146b表達(dá)高于非紫紺組，同時(shí)在體外慢性缺氧H9c2細(xì)胞模型中，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)miR-146b表達(dá)緩慢上升。
　　2.在H9c2細(xì)胞系中，下調(diào)miR-146b可顯著增加缺氧所致的心肌凋亡。
　　3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告基因和Western-Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNase L為miR-146b靶基因
　　4.并且在心肌慢性缺氧模型中下調(diào)miR-146b表達(dá)，NF-