MiR-224在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其功能分析.pdf

1、背景和目的：MircoRNAs(miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，長約20—24 nt，由一段具有發(fā)央樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長約70—80 nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶加工后生成后生成。miRNAs通過與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，在翻譯水平上特異性抑制基因表達(dá)，參與調(diào)控生物生長和發(fā)育等許多復(fù)雜的生命過程。許多miRNAs的序列在起源甚遠(yuǎn)的物種之間相對保

2、守，雖然這些miRNAs的生物學(xué)功能目前還不十分清楚，但可以肯定的是它們有不同的表達(dá)模式，同時(shí)參與調(diào)節(jié)各種生理病理過程。異常的miRNAs表達(dá)與人類某些疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)，miRNAs被認(rèn)為是一組新的癌或抑癌基因，其表達(dá)具有特異性的腫瘤組織表達(dá)譜。 原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿、預(yù)后差、死亡率高。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在肝癌組織中異常表達(dá)，它可能參與了肝細(xì)胞癌變的病理過程。在我

3、們的研究中利用miRNA芯片技術(shù)篩選肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞LO2中miRNAs的差異表達(dá)譜，通過定量RT-PCR和Northern blot等方法驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道中的肝癌及癌旁肝組織中miRNAs表達(dá)模式，篩選出在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)的miR-224作為研究的靶標(biāo)，均表達(dá)明顯上調(diào)。利用MTT、流式細(xì)胞儀(FACS)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和Metrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等技術(shù)和方法分析m1R-22

4、4是否對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖與凋亡、遷移與侵襲等生物學(xué)行為有無影響，其結(jié)果表明miR-224參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡，特別是能明顯的促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲力，但對細(xì)胞周期的進(jìn)程無明顯影響。 研究miRAN功能的關(guān)鍵是尋找其調(diào)控的下游靶基因。目前，有多個(gè)應(yīng)用：生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA靶基因的軟件，包括MIRANDA，PICTAR，Target Scan等算法對目的miRNAs的3’端序列搜索靶基因，尋找miRNAs可

5、能在mRNA水平起作用的下游靶基因。應(yīng)用MIRANDA和PICTAR的生物信息學(xué)方法對miR-224的靶基因進(jìn)行預(yù)測，并以m1R-224參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲力為突破口，在預(yù)測的靶基因中挑選出PAK4進(jìn)行分析和初步驗(yàn)證，目的在于尋找m1R-224直接調(diào)控的靶基因，為闡明miR-224參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲力參與調(diào)控的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，進(jìn)一步使我們更加全面地理解miRNA在肝癌發(fā)生機(jī)制中的作用，為尋找肝癌治療的新靶點(diǎn)提供有

6、效的途徑。 方法： 1.應(yīng)用miRNA基因芯片技術(shù)，通過基因雜交、T4-RNA連接酶標(biāo)記的方法，檢測肝癌細(xì)胞株HepG2和正常肝L02細(xì)胞中miRNA表達(dá)的差異譜。通過定量RT-PCR和Northern blot的方法證實(shí)了miRNA基因芯片結(jié)果的真實(shí)可靠性。 2.利用MTT、流式細(xì)胞儀(FACS)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和Metrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等技術(shù)和方法分析miR-224對細(xì)胞周期、細(xì)胞增

7、殖與凋亡、遷移與侵襲等生物學(xué)行為的影響。 3.應(yīng)用不同的生物信息學(xué)方法對在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的nuR-224的靶基因進(jìn)行預(yù)測。 4.應(yīng)用免疫組化方法和組織芯片技術(shù)分析預(yù)測的靶基因PAK4在肝癌組織中的表達(dá)情況，并分析PAK4及其磷酸化狀態(tài)與腫瘤的臨床病理學(xué)因素之間的關(guān)系。 5.應(yīng)用Western blot法分析miR-224與PAK4和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果： 1.MiRNA基因

8、芯片結(jié)果顯示與LO2細(xì)胞相比，在HepG2肝癌細(xì)胞中有143個(gè)miRNAs的表達(dá)具有顯著差異，F(xiàn)old Change在4倍以上(其中66個(gè)上調(diào)和77個(gè)下調(diào))，miR-224在不同的肝癌細(xì)胞株和肝癌組織中表達(dá)模式一致，均表達(dá)明顯上調(diào)。 2.M1R-224參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡、遷移與侵襲等生物學(xué)過程，但對細(xì)胞周期的進(jìn)程無明顯影響。 3.M1R-224對肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲力有明顯的促進(jìn)作用。 4.預(yù)測miR-

9、224的靶基因有數(shù)百個(gè)，其多個(gè)基因涉及細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡等眾多生物學(xué)過程，說明miR-224在肝癌發(fā)生發(fā)展中有著重要的生物學(xué)功能。但預(yù)測的PAK4基因不是m1R-224直接調(diào)控的靶基因。 5.在肝癌組織中PAK4的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常肝組織，而同樣在肝癌組織中磷酸化PAK4的表達(dá)水平又明顯高于非磷酸化PAK4的表達(dá)。而且，磷酸化PAK4主要在胞核表達(dá)，其核表達(dá)的強(qiáng)陽性率與細(xì)胞分化程度的高低和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)