新基因URG4在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞生長的影響.pdf

1、【背景】
　　肝細胞肝癌（HCC，以下簡稱肝癌）是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害國人的健康。我國肝癌的主要病因為乙型肝炎病毒（HBV）的長期慢性感染，并且HBVX開放讀框編碼的乙肝病毒X蛋白（HBx）在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。HBx具有轉(zhuǎn)錄激活子功能，調(diào)節(jié)細胞中許多與細胞凋亡和周期相關(guān)的基因的表達；HBx能調(diào)節(jié)胞漿中的多種信號轉(zhuǎn)導途徑；HBx能影響DNA修復。但上述這些機制只能部分解釋HBx在HBV誘導肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

2、。HBx發(fā)揮作用的機制還存在許多不明之處。為了進一步尋找HBx發(fā)揮作用的其它分子，我們課題組運用抑制消減雜交及全長PCR擴增技術(shù)（RACE-PCR）克隆出了一個可以被HBx蛋白上調(diào)新基因URG4（Upregulatedgene4），該基因全長3607bp，編碼104KD的蛋白。經(jīng)NIH人類基因組數(shù)據(jù)庫比較，此基因定位在人類7號染色體，無同源基因。蛋白質(zhì)綜合信息庫分析（SWISSPROT），此蛋白具有一個穿膜螺旋（Transmembran

3、e helices:336-353）；三個核內(nèi)信號定位肽(Nuclear localization signals:PYRGKRN380、PRPRDKR821、PRDKRQL823)；一個ATP/GTP結(jié)合區(qū)（ATP/GTP binding site690-697 GVPGTGKS），與caspase修復成員6（caspase recruitment domain family6）在88-461氨基酸之間有34％同源。初步研究發(fā)現(xiàn)此基因

4、不僅可以促進腫瘤細胞生長，還可促進腫瘤細胞在體內(nèi)的成瘤性，為又一新的促癌基因。但其發(fā)揮作用的分子機制還不清楚。
　　【目的】
　　1、檢測URG4在肝癌組織及肝癌細胞系中的表達及意義。
　　2、探討URG4與HBx在肝癌組織及細胞中表達之間的關(guān)系。
　　3、檢測URG4對肝癌細胞生長的影響及相關(guān)機制。
　　【方法】
　　1、免疫組化方法檢測URG4和HBx在正常組織、肝癌組織及癌旁組織中的表達分布，并

5、分析其表達的意義及表達之間的相關(guān)性。
　　2、RT-PCR和Westernblot檢測肝癌細胞系（HHCC、HepG2和SMMC-7721）、永生化肝細胞QZG及轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細胞中URG4的mRNA及蛋白的表達。
　　3、脂質(zhì)體法將URG4基因的真核表達載體轉(zhuǎn)入QZG細胞，將URG4特異SiRNA載體轉(zhuǎn)染入肝癌HepG2細胞中，G418篩選穩(wěn)定表達的單集落。
　　4、MTT法繪制轉(zhuǎn)染細胞及其對照細胞的生長曲線。

6、
　　5、流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染細胞及其對照細胞的細胞周期分布。
　　6、平板集落形成實驗檢測轉(zhuǎn)染細胞及對照細胞的集落形成能力。
　　7、軟瓊脂集落形成實驗檢測URG4表達抑制后，肝癌細胞的體外成瘤能力的變化。
　　8、Westernblot和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞周期相關(guān)分子cyclinD1的變化。
　　【結(jié)果】
　　1、URG4在肝癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達
　　100例肝癌

7、標本中，48例URG4陽性表達，陽性表達率為48％；癌旁組織中URG4陽性表達54例（54％），并且URG4主要表達在肝硬化組織中；在27例正常組織中，僅6例弱表達URG4，陽性率22.2％。同時在肝癌細胞系HHCC、HepG2和SMMC-7721中可檢測到不同程度的URG4mRNA及蛋白的表達，以HepG2細胞中表達最高，但在永生化肝細胞QZG中沒有檢測到URG4的表達。URG4在肝癌和癌旁肝硬化組織中的表達高于正常組織，在肝癌細胞系

8、中的表達也高于永生化細胞。
　　2、HBx在肝癌組織和癌旁組織中的表達及其與URG4表達的關(guān)系
　　肝癌細胞中HBx幾乎全部表達于細胞質(zhì)中，偶見部分核染色。78例乙肝相關(guān)性肝癌標本中，60例HBx陽性表達，陽性表達率為76.9％；癌旁組織中HBx陽性表達65例（83.3％），并且HBx也主要表達在肝硬化組織中；在27例正常組織中，沒有檢測到HBx的表達。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HBx和URG4表達的相關(guān)系數(shù)0.38（P<0.

9、05），并且在肝癌癌旁組織中的相關(guān)系數(shù)0.45（P<0.05）。HBx基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中，URG4mRNA和蛋白表達水平均上調(diào)。
　　3、URG4對肝癌細胞生長的影響
　　將URG4正義載體轉(zhuǎn)染入QZG細胞后，發(fā)現(xiàn)QZG細胞生長加快，由G1期進入S期的細胞比例增加；將URG4-siRNA轉(zhuǎn)染入肝癌細胞HepG2后，HepG2細胞的生長顯著減慢，錨定非依賴性生長的能力、單細胞集落形成能力以及裸鼠體內(nèi)成瘤能力均顯著減