小鼠pEGFP-NeuroD重組質粒的構建及其在肝癌細胞中的表達后功能的初步探討.pdf

1、實驗目的： 神經分化因子1（NeuroD-1）又名B細胞E盒轉錄激活因子2（BETA-2），屬于組織特異性的B類bHLH蛋白，作為轉錄因子，NeuroD-1基因是β細胞特異和有效表達胰島素基因所必需。在基因敲除小鼠的研究中發(fā)現[1]，BETA-2基因缺失的小鼠因為β細胞數量的大量減少和缺少適量的胰島形成，出現嚴重的糖尿病并在圍產期死亡。最近cao[2]等應用基因轉染方法將表達PDX-1的基因體外轉染肝細胞，結果發(fā)現在高糖條件下肝

2、細胞被誘導分泌胰島素。這就提示，在一定條件下，胰島素在肝臟的異位表達是可以實現的。本實驗擬構建pEGFP-NeuroD表達質粒載體，體外轉染肝癌細胞（HepG2），觀察HepG2細胞在不同條件下NeuroD-1和胰島素的表達，從而探討體外表達NeuroD-1誘導肝癌細胞分泌胰島素的可能性。 實驗方法： 1.以重組質粒Pcr3.1-NeuroD為模板，用PCR方法擴增出NeuroD-1基因，構建入含增強綠色熒光蛋白的表達質

3、粒pEGFP-Cl，構建可以表達NeuroD-1基因的質粒載體pEGFP-NeuroD。 2.將表達質粒pEGFP-NeuroD用脂質體法轉染三種不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的HepG2細胞，熒光顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白的表達；利用RT-PCR方法檢測NeuroD-1及胰島素的表達；用Western Blot檢測NeuroD-EGFP融合蛋白的表達。 實驗結果： 1.成功構建了pEGFP-NeuroD表達質粒。 2

4、.重組質粒體外成功轉染入HepG2細胞，在熒光顯微鏡下可見強綠色熒光蛋白的表達，重組質粒轉染率在30～40％之間；RT-PCR方法及Western Blot在三種不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的HepG2細胞組中均檢測到NeuroD-1的表達，其中RT-PCR方法擴增出NeuroD-1 mRNA大小是634bp，NeuroD-EGFP融合蛋白Mr大小67×103，但是三組間基因表達量均無明顯差異。 3.RT-PCR法未檢測到肝癌細胞胰島素的