pcDNA3(-)SVT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在小鼠小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，小腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial cells，IEC)是腸道主要的功能細(xì)胞，參與腸道食糜的消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等，并與腸道的內(nèi)、外分泌功能有密切關(guān)系。原代培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞費(fèi)時(shí)費(fèi)力，傳代次數(shù)有限，在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生理功能容易變異，造成試驗(yàn)結(jié)果因細(xì)胞代數(shù)不同而難以比較。建立永生化小腸上皮細(xì)胞系，可以為研究腸道微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)和小腸上皮細(xì)胞的增殖分化提供重要的研究工具。本文旨

2、在利用SV40T能促進(jìn)細(xì)胞永生化的功能，構(gòu)建含有SV40T基因的真核表達(dá)載體，將重組克隆轉(zhuǎn)染小鼠小腸上皮細(xì)胞，進(jìn)行小鼠小腸上皮細(xì)胞的永生化研究，為永生化小鼠小腸上皮細(xì)胞系的建立提供參考依據(jù)。 設(shè)計(jì)并構(gòu)建pcDNA3(-)SVT真核表達(dá)載體。PVUII酶切改造pcDNA3真核表達(dá)載體，改造產(chǎn)物命名為pcDNA3(-)，XhoII酶切pGEM-LT，電泳膠回收得到SV40T基因片段，將其插入pcDNA3(-)真核表達(dá)載體，PSTI酶

3、切連接產(chǎn)物，通過瓊脂糖電泳篩選出插入方向正確的連接產(chǎn)物，并將其送生物公司測(cè)序。 探索小鼠小腸上皮細(xì)胞的分離純化方法，得到純度較高的小鼠小腸上皮細(xì)胞。以胎鼠小腸為材料，通過組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代小鼠小腸上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)，采用刮除法和相差消化及相差貼壁法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，用0.05％ Trypsin-EDTA進(jìn)行消化傳代，通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)進(jìn)行鑒定。 將SV40 T基因?qū)胄∈笮∧c上皮細(xì)胞，進(jìn)行永生化研究。采用脂質(zhì)體

4、轉(zhuǎn)染法，將編碼SV40 T基因的真核表達(dá)載體pcDNA3(-)SVT導(dǎo)入經(jīng)純化的小鼠小腸上皮細(xì)胞，以pEGFP-N1為報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，通過PCR和RT-PCR檢測(cè)SV40 T基因在小鼠小腸上皮細(xì)胞中成功表達(dá)。 結(jié)果表明：真核表達(dá)載體pcDNA3(-)SVT構(gòu)建成功，為利用SV40 T抗原進(jìn)行真核細(xì)胞永生化研究提供了穩(wěn)定、可靠的分子工具。通過組織塊培養(yǎng)法得到的小鼠小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，增殖旺盛，經(jīng)過純化，得到了純度較高的