小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞在抵抗鼠傷寒沙門氏菌感染中的作用.pdf

1、研究目的:
　　腸道是接觸大量食物抗原和微生物定居的主要場(chǎng)所。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御腸道病原體感染的第一道防線，同時(shí)也在宿主與外環(huán)境間建立和維持穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要的作用。鼠傷寒沙門氏菌是主要的腸道致病菌，是導(dǎo)致食物來(lái)源的疾病和腹瀉的常見(jiàn)病因，其致病因子主要包括毒力島SPI、pSLT毒力質(zhì)粒、粘附素、鞭毛等。腸道免疫細(xì)胞在抵抗病原菌感染中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。腸道粘膜上皮層由上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IELs)和上皮細(xì)胞(IECs)組成，大

2、約每6-10個(gè)上皮細(xì)胞中就有一個(gè)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，上皮細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞共同形成了腸道抵抗外界感染的第一道屏障。
　　腸上皮在腸道黏膜的免疫反應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，是阻止過(guò)量病原菌和其他抗原由腸腔進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的一道關(guān)鍵的物理屏障。已有研究表明腸上皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間緊密連接以及細(xì)胞因子和抗菌肽的分泌，抵抗病原菌的侵襲。腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是一類獨(dú)特的殺傷性淋巴細(xì)胞群，通過(guò)維持上皮細(xì)胞的屏障功能，調(diào)節(jié)獲得性和天然免疫，抵抗病原菌感染。因此，

3、腸上皮細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞在抵抗病原菌感染中均能發(fā)揮重要作用。同時(shí)上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-15對(duì)CD8αα+IEL細(xì)胞的比例及功能有重要影響，并能促進(jìn)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，影響上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的功能。腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ和TNF-α影響上皮細(xì)胞的緊密連接分子的表達(dá)。但是，目前對(duì)腸上皮細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞相互調(diào)節(jié)在抵抗病原菌感染中的作用的研究尚少。本研究通過(guò)腸道感染模型的建立，觀察

4、小鼠經(jīng)口感染鼠傷寒沙門氏菌后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞在抵抗病原菌感染中發(fā)揮的作用，并探討其清除感染病原菌過(guò)程中是否存在相互調(diào)節(jié)作用，為腸道感染性疾病的治療提供新的方向。
　　方法:
　　1.灌胃感染鼠傷寒沙門氏菌，建立小鼠腸道感染模型。通過(guò)小鼠體重、腸外觀、HE染色和載菌量檢測(cè)感染模型是否成功建立。
　　2.WesternBlot和定量PCR檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌感染后上皮細(xì)胞炎癥小體(NLRP3、NLRC4)表達(dá)的變化

5、。
　　3.WesternBlot和定量PCR檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌感染后上皮細(xì)胞抗菌肽(β-defensin3、β-defensin4)的表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗菌物質(zhì)ROS的表達(dá)變化。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌后，IELs活化分子(CD44、CD69)及殺傷相關(guān)分子(NKG2D、CD107a、IFN-γ)的表達(dá)變化。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-1β刺激IELs后對(duì)其表達(dá)活化及殺傷相關(guān)分子的影響。

6、
　　6.LDH法檢測(cè)IL-1β刺激IELs后對(duì)其殺傷感染上皮細(xì)胞的影響。
　　7.LDH法檢測(cè)加入anti-IL-1β阻斷抗體后，IELs對(duì)鼠傷寒沙門氏菌感染上皮細(xì)胞殺傷效率的變化。
　　8.Tranwell法檢測(cè)感染上皮細(xì)胞對(duì)IELs趨化能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立鼠傷寒沙門氏菌腸道感染模型。
　　2.鼠傷寒沙門氏菌感染后小腸上皮細(xì)胞后炎癥小體NLRP3和NLRC4的表達(dá)上調(diào)，cas

7、pase-1的活化增加，成熟IL-1β的分泌增加。
　　3.鼠傷寒沙門氏菌感染小腸上皮細(xì)胞后抗菌物質(zhì)ROS、defensin-β3和defensin-β4表達(dá)上調(diào)。
　　4.鼠傷寒沙門氏菌感染時(shí)CD8α+TCRγδ+IELs亞群的比例增加，同時(shí)活化相關(guān)分子(CD44、CD69)和殺傷相關(guān)分子(NKG2D、CD107a、IFN-γ)的表達(dá)上調(diào)。
　　5.鼠傷寒沙門氏菌感染腸道后CD8αα+IELs、CD8αβ+IELs活

8、化相關(guān)分子(CD44、CD69)和殺傷相關(guān)分子(NKG2D、CD107a、IFN-γ)表達(dá)上調(diào)。
　　6.鼠傷寒沙門氏菌感染后IELs對(duì)上皮細(xì)胞的殺傷能力明顯增強(qiáng)。
　　7.體外加入IL-1β促進(jìn)IELs對(duì)傷寒感染上皮細(xì)胞的殺傷能力。
　　8.傷寒感染的上皮細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子促進(jìn)對(duì)IELs的趨化。
　　結(jié)論:
　　1.小腸上皮細(xì)胞通過(guò)炎癥小體的活化和抗菌物質(zhì)的分泌，在抵抗鼠傷寒沙門氏菌感染中發(fā)揮重要作用。<