LED209阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC群體感應(yīng)系統(tǒng)體內(nèi)抗感染作用機(jī)理研究.pdf

1、目的：抗生素的濫用導(dǎo)致了多重耐藥細(xì)菌和泛耐藥細(xì)菌的大量出現(xiàn)和蔓延，已成為危害人類健康的嚴(yán)重災(zāi)難，也是當(dāng)前公共衛(wèi)生領(lǐng)域各國(guó)政府高度關(guān)注的焦點(diǎn)。由于抗生素在應(yīng)用過(guò)程中會(huì)不可避免地誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，新抗生素用于臨床后細(xì)菌很快就會(huì)產(chǎn)生耐藥，因此傳統(tǒng)抗生素的研制并不能從根本上解決細(xì)菌耐藥問(wèn)題。而且抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了新抗生素研發(fā)的速度，臨床有效的抗菌藥物日趨減少。因此，研發(fā)不易誘導(dǎo)耐藥新型抗菌藥物是抗感染藥物研究領(lǐng)域當(dāng)務(wù)之急的研究目

2、標(biāo)。
　　細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（QSS）在細(xì)菌毒力因子表達(dá)調(diào)控、耐藥性產(chǎn)生、生物膜形成、休眠體形成和免疫逃逸等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。阻斷細(xì)菌QSS可以抑制其毒力和致病力，而不直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)或活力，細(xì)菌不會(huì)受到較強(qiáng)的選擇性生存壓力，因此不易導(dǎo)致耐藥性的快速產(chǎn)生。因此，以QSS為靶點(diǎn)的群體感應(yīng)抑制劑（QSI）的研究倍受重視，成為新型抗菌藥物研發(fā)領(lǐng)域的新方向。
　　QseC是廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌表面的群體感應(yīng)系統(tǒng)，至少25種

3、重要致病細(xì)菌表達(dá)QseC，這些QseC具有較高同源性，參與調(diào)控細(xì)菌毒力、侵襲力和致病性。Rasko等通過(guò)對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，首次獲得了一種選擇性作用于QseC的抑制劑LED209，并證實(shí)LED209在體外能抑制細(xì)菌毒力基因表達(dá)，體內(nèi)能顯著降低感染鼠傷寒沙門氏菌或土拉熱弗朗西絲菌的小鼠的死亡率和臟器荷菌量。然而，目前所知包括 LED209在內(nèi)的所有群體感應(yīng)抑制劑在體外均無(wú)殺菌和抑菌作用，但在感染動(dòng)物體內(nèi)卻能發(fā)揮有效的抗感染保護(hù)效應(yīng)，

4、迄今為止，這一現(xiàn)象的內(nèi)在規(guī)律和作用機(jī)理幾乎完全不清楚。前期的研究顯示，阻斷細(xì)菌QSS可以調(diào)控感染小鼠體內(nèi)多種細(xì)胞因子的分泌水平，提示機(jī)體天然免疫系統(tǒng)可能參與了 QSI的抗感染保護(hù)效應(yīng)。因此，推測(cè)QseC抑制劑LED209進(jìn)入機(jī)體后，很可能通過(guò)某種機(jī)制啟動(dòng)了機(jī)體天然免疫抗菌應(yīng)答效應(yīng)，繼而殺滅和清除體內(nèi)細(xì)菌。本課題針對(duì)上述未知問(wèn)題和我們的推測(cè)，選擇臨床感染較為常見(jiàn)、耐藥率高的鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium, S

5、. Typhimurium）作為研究對(duì)象，構(gòu)建QseC群體感應(yīng)系統(tǒng)缺失的qseC敲除株，并利用QseC特異性抑制劑LED209作為工具藥，揭示阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC，或者敲除qseC基因后，何種免疫細(xì)胞參與體內(nèi)抗感染保護(hù)效應(yīng)，探索免疫細(xì)胞與抗感染保護(hù)效應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)系和分子機(jī)理。
　　方法：
　　1.構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌qseC基因敲除株△qseC。采用RED同源重組技術(shù)，根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌 qseC基因（GenBank Nu

6、mber:NC_003197.2）的上下游序列和質(zhì)粒 pKD3的氯霉素抗性序列（Cm），設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物，分別用于擴(kuò)增qseC基因上下游同源臂和氯霉素抗性片段。通過(guò)融合PCR實(shí)驗(yàn)，將三個(gè)片段連接為線性打靶DNA。將線性打靶DNA電轉(zhuǎn)入含有pKD46質(zhì)粒的鼠傷寒沙門氏菌感受態(tài)，篩選氯霉素陽(yáng)性單克隆，即為qseC基因替換為氯霉素抗性的菌株。最后通過(guò)pCP20表達(dá)FLP重組酶，刪除FRT位點(diǎn)間的氯霉素抗性序列，即可得到無(wú)抗性的鼠傷寒沙門氏菌

7、qseC敲除株△qseC。
　　2. LED209對(duì)體外培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)的影響。采用微量稀釋法檢測(cè)LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的最低抑菌濃度（MIC）。用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光度（OD600），觀察LED209在5 nM、500 nM和50μM濃度范圍內(nèi)，以及敲除qseC基因后對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，以左氧氟沙星作為陽(yáng)性對(duì)照抗生素，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。
　　3. LED209對(duì)鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠的保護(hù)作用

8、。BALB/c小鼠隨機(jī)分為野生型鼠傷寒沙門氏菌感染組（WT）、qseC敲除株感染組（ΔqesC）和LED209處理組。分別給小鼠腹腔注射WT或ΔqesC菌液1.0×108 CFU，構(gòu)建小鼠膿毒癥模型。LED209處理組分別于感染前、感染后3小時(shí)灌胃給予LED20920 mg/kg。記錄上述各組小鼠感染后48小時(shí)內(nèi)生存情況，繪制生存曲線。于感染后20小時(shí)，取部分肝臟、脾臟勻漿后涂布于瓊脂平板，計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU。制備感染小鼠肝臟、脾臟病理切片

9、，HE染色后評(píng)價(jià)各組感染小鼠臟器病理?yè)p傷。分離感染小鼠肝臟、脾臟中的鼠傷寒沙門氏菌，使用熒光定量PCR法檢測(cè)其重要毒力因子的mRNA表達(dá)水平。
　　4.清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)LED209體內(nèi)抗感染作用的影響。仿文獻(xiàn)給予BALB/c小鼠腹腔注射200μL濃度為5 mg/mL的氯膦酸二鈉脂質(zhì)體（clodronate-liposomes），清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞。在注射后24小時(shí)進(jìn)行感染，記錄各組小鼠感染后48小時(shí)內(nèi)生存情況，計(jì)數(shù)感染后2

10、0小時(shí)小鼠肝臟、脾臟內(nèi)細(xì)菌CFU，評(píng)價(jià)清除巨噬細(xì)胞后對(duì)LED209小鼠體內(nèi)抗感染效果的影響。
　　5.阻斷QseC系統(tǒng)調(diào)控巨噬抗菌應(yīng)答效應(yīng)的機(jī)理
　　5.1仿文獻(xiàn)分離 BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，建立巨噬細(xì)胞和鼠傷寒沙門氏菌體外共培養(yǎng)模型。感染后1小時(shí)，拍照記錄感染后巨噬細(xì)胞形態(tài)，并收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行LDH檢測(cè)，計(jì)算巨噬細(xì)胞死亡率。受感染巨噬細(xì)胞進(jìn)行DAPI和PI雙染，計(jì)算PI陽(yáng)性細(xì)胞的百分率以評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞膜完整性

11、和死亡率。
　　5.2使用RIPK1特異性抑制劑Nec-1或caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk預(yù)處理巨噬細(xì)胞后進(jìn)行感染，感染后1小時(shí)收集細(xì)胞上清檢測(cè)LDH釋放量，計(jì)算巨噬細(xì)胞死亡率。
　　5.3巨噬細(xì)胞感染后指定時(shí)間點(diǎn)，提取上清蛋白檢測(cè)caspase-1和IL-1β活化形式的表達(dá)水平，并使用ELISA檢測(cè)上清IL-1β的釋放量，評(píng)價(jià)阻斷QseC對(duì)感染后巨噬細(xì)胞炎性復(fù)合體活化的影響。
　　5.4鼠傷寒沙

12、門氏菌感染小鼠后8小時(shí)，收集小鼠血清和腹腔灌流液，ELISA檢測(cè)IL-1β的分泌量。獲取感染后小鼠腹腔細(xì)胞，使用PI和F4/80抗體標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，計(jì)算雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率，評(píng)價(jià)感染后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的焦亡率。提取感染后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)caspase-1和IL-1β活化形式的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)阻斷QseC對(duì)感染后體內(nèi)巨噬細(xì)胞炎性復(fù)合體活化的影響。
　　5.5使用siRNA沉默巨噬細(xì)胞NLRP3和NLRC4炎性復(fù)合體后

13、進(jìn)行感染，1小時(shí)后收集細(xì)胞上清檢測(cè)LDH含量，計(jì)算巨噬細(xì)胞焦亡率。使用DAPI和PI雙染后計(jì)算PI陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。western blotting檢測(cè)沉默NLRC4炎性復(fù)合體后受感染巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β活化形式的表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)上清中IL-1β的釋放量。
　　5.6鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞后1、8和16小時(shí)，使用1％ Trition X-100裂解細(xì)胞，裂解液梯度稀釋后涂布瓊脂平板計(jì)數(shù)胞內(nèi)存活細(xì)菌的C

14、FU。
　　5.7鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞后8小時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NADPH氧化酶和iNOS的表達(dá)水平。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測(cè)過(guò)氧化氫和一氧化氮的含量。評(píng)價(jià)阻斷QseC對(duì)感染后巨噬細(xì)胞活性氧和活性氮表達(dá)及合成的影響。
　　5.8使用iNOS抑制劑L-NMMA和NADPH氧化酶抑制劑DPI預(yù)處理巨噬細(xì)胞后進(jìn)行感染，計(jì)數(shù)胞內(nèi)細(xì)菌 CFU，評(píng)價(jià)阻斷 QseC后對(duì)巨噬細(xì)胞活性氧和活性氮?dú)⒕芰Φ挠绊憽?br>　　5.9于LB培

15、養(yǎng)基中加入過(guò)氧化氫或亞硝酸鈉，每2小時(shí)取菌液梯度稀釋后涂布瓊脂平板，計(jì)數(shù)細(xì)菌 CFU，評(píng)價(jià)阻斷 QseC后細(xì)菌對(duì)活性氧和活性氮?dú)拿舾行浴?br>　　5.10氯喹抵抗實(shí)驗(yàn)：氯喹處理細(xì)胞后，會(huì)在SCV中積累并最終殺死SCV中的細(xì)菌。通過(guò)比較氯喹處理與否的胞內(nèi)細(xì)菌CFU，評(píng)價(jià)阻斷QseC對(duì)于細(xì)菌SCV的影響。
　　5.11溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)：用生物素標(biāo)記細(xì)菌，預(yù)先使親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)運(yùn)到巨噬細(xì)胞溶酶體，通過(guò)檢測(cè)吸光度評(píng)價(jià)溶酶體

16、與細(xì)菌的融合能力。
　　5.12給予感染小鼠腹腔注射 caspase-1特異性抑制劑 Ac-YVAD-cmk或活性氧活性氮抑制劑DPI，記錄感染小鼠生存率和生存時(shí)間，計(jì)數(shù)感染小鼠肝臟、脾臟細(xì)菌CFU。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌qseC敲除株△qseC。通過(guò) RED同源重組技術(shù)構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌 qseC基因敲除株△qseC，經(jīng) PCR鑒定及測(cè)序鑒定，確證鼠傷寒沙門氏菌qseC基因已被成功敲除。

17、　　2. LED209不影響體外培養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)。MIC結(jié)果顯示，256μg/mL的LED209未表現(xiàn)出抑菌或殺菌作用。LED209在5 nM~50μM濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯影響。qseC缺失菌株的生長(zhǎng)情況與野生型菌株也無(wú)顯著差異。表明阻斷鼠傷寒沙門氏菌QseC或者敲除其qseC基因，均對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
　　3. LED209在感染小鼠體內(nèi)能夠發(fā)揮抗感染保護(hù)效應(yīng)。WT鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠在48小時(shí)內(nèi)全部死亡，而LED

18、209處理組感染后48小時(shí)仍有50%小鼠存活，ΔqesC菌株感染小鼠在感染后48小時(shí)全部存活。與WT菌感染組相比，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組小鼠肝臟、脾臟細(xì)菌菌落數(shù)顯著減少，且臟器病理?yè)p傷顯著減輕。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，LED209處理組和ΔqesC菌株在感染小鼠體內(nèi)致病相關(guān)毒力因子flhDC、sifA和sopB的表達(dá)顯著降低。上述結(jié)果確證，LED209在體內(nèi)能夠發(fā)揮有效的抗感染作用。
　　4.巨噬細(xì)胞參與介導(dǎo)了L

19、ED209體內(nèi)抗感染保護(hù)效應(yīng)。為了明確 LED209體內(nèi)抗感染保護(hù)效應(yīng)與何種免疫細(xì)胞相關(guān)，我們先用氯膦酸脂質(zhì)體清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞，然后進(jìn)行感染。結(jié)果顯示，LED209體內(nèi)抗感染保護(hù)效應(yīng)顯著減弱，小鼠存活率由50%降低至10%，ΔqesC菌株感染小鼠的存活率則由100%降低至30%，肝臟、脾臟荷菌量顯著升高。上述結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞參與介導(dǎo)了LED209體內(nèi)抗感染保護(hù)效應(yīng)。
　　5. LED209能夠抑制鼠傷寒沙門氏菌感染所致的巨噬

20、細(xì)胞死亡。在巨噬細(xì)胞和鼠傷寒沙門氏菌體外共培養(yǎng)模型上觀察發(fā)現(xiàn)，WT菌株感染后1小時(shí)，大量巨噬細(xì)胞發(fā)生腫脹、破膜和死亡，而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細(xì)胞形態(tài)完好，與未感染對(duì)照組無(wú)明顯差異。LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，在WT菌株感染后1小時(shí)，60%以上受感染感染巨噬細(xì)胞發(fā)生死亡，而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組僅有10%的巨噬細(xì)胞發(fā)生死亡。DAPI和PI雙染結(jié)果顯示，WT菌株感染后1小時(shí)，巨噬細(xì)胞PI陽(yáng)性百分率顯著升高，

21、而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細(xì)胞PI陽(yáng)性百分率顯著低于WT菌株感染組。以上結(jié)果表明，LED209阻斷QseC能夠顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡的效應(yīng)。
　　6.鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡屬焦亡，LED209可抑制受感染巨噬細(xì)胞焦亡的發(fā)生。近期研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌感染可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡和焦亡。壞死性凋亡可以被RIPK1特異性抑制劑necrostatin-1（Nec-1）阻斷；焦

22、亡則可以被caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk阻斷。分別用Nec-1或Ac-YVAD-cmk預(yù)處理巨噬細(xì)胞，然后用細(xì)菌感染細(xì)胞，感染后1小時(shí)收集細(xì)胞上清檢測(cè)LDH釋放量。結(jié)果顯示，Ac-YVAD-cmk預(yù)處理則可以顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡。表明鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡方式為焦亡，LED209阻斷QseC能夠抑制鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。
　　7.鼠傷寒沙門氏菌感染誘導(dǎo)的巨

23、噬細(xì)胞快速焦亡由 NLRC4炎性復(fù)合體介導(dǎo)， LED209阻斷細(xì)菌QseC能夠抑制NLRC4-caspase-1-IL-1β信號(hào)通路活化，繼而抑制巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡。進(jìn)一步探討阻斷細(xì)菌QseC如何抑制受感染巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，在體外細(xì)菌和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型以及膿毒癥模型小鼠上觀察炎性復(fù)合體信號(hào)通路的活化情況。體外結(jié)果顯示，WT菌株感染組巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β活化形式的表達(dá)水平顯著增加，分泌至上清中IL-1β的濃度顯著升高，表

24、明WT菌株感染誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞炎性復(fù)合體的激活。而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細(xì)胞caspase-1和IL-1β活化形式的表達(dá)水平與未感染時(shí)相比無(wú)顯著差異，培養(yǎng)液上清中的IL-1β濃度也無(wú)明顯升高。體內(nèi)結(jié)果顯示，WT菌株感染組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞焦亡率、腹腔巨噬細(xì)胞caspas-1和IL-1β活化形式的表達(dá)水平以及小鼠血清和腹腔灌流液中IL-1β的分泌量均顯著高于LED209處理組和ΔqesC菌株感染組小鼠。
　　用si

25、RNA分別沉默巨噬細(xì)胞NLRP3或NLRC4炎性復(fù)合體，然后以細(xì)菌感染細(xì)胞，檢測(cè)培養(yǎng)上清中LDH釋放量，并計(jì)算巨噬細(xì)胞焦亡率。結(jié)果顯示，沉默NLRC4炎性復(fù)合體后，受感染巨噬細(xì)胞焦亡率和PI陽(yáng)性百分率顯著降低，caspase-1和IL-1β活化形式的表達(dá)水平顯著降低，培養(yǎng)上清中IL-1β的濃度顯著降低，表明NLRC4炎性復(fù)合體參與介導(dǎo)了感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。
　　進(jìn)一步檢測(cè)能夠活化NLRC4的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛基因flhDC的表

26、達(dá)及其功能，結(jié)果顯示，LED209阻斷QseC后鼠傷寒沙門氏菌flhDC基因表達(dá)水平顯著降低，細(xì)菌鞭毛動(dòng)力顯著減弱。結(jié)果提示，LED209可能通過(guò)阻斷 QseC，抑制鼠傷寒沙門氏菌鞭毛基因flhDC的表達(dá)，進(jìn)而抑制NLRC4炎性復(fù)合體活化，最終抑制巨噬細(xì)胞的焦亡。
　　8. LED209能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除。上述結(jié)果表明LED209通過(guò)阻斷QseC，進(jìn)而抑制感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡，那么被巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入胞內(nèi)的細(xì)菌命運(yùn)又如何

27、呢？研究結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞后1小時(shí)，WT菌株感染組、LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌CFU無(wú)顯著性差異，表明巨噬細(xì)胞對(duì)三組細(xì)菌的吞噬能力沒(méi)有差異。感染后8和16小時(shí)，WT菌株感染組細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的CFU呈現(xiàn)時(shí)間依賴性升高，表明細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)增殖。而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組胞內(nèi)細(xì)菌CFU在感染后8、16小時(shí)則表現(xiàn)為時(shí)間依賴性減少，表明LED209阻斷QseC或敲除qseC基因后，可

28、以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除。
　　9. LED209能夠增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)活性氧和活性氮?dú)拿舾行?。進(jìn)一步探討阻斷細(xì)菌QseC或敲除qseC基因?yàn)楹文艽龠M(jìn)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)殺菌，檢測(cè)與巨噬細(xì)胞胞內(nèi)殺菌相關(guān)的活性氧和活性氮相關(guān)酶的表達(dá)水平和含量變化。結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的三個(gè)重要亞基gp91phox、p22phox、p47phox以及iNOS的表達(dá)水平，上清中一氧化氮和過(guò)氧化氫的含量，在三個(gè)感染組間均無(wú)顯著差異。表明阻斷細(xì)菌

29、QseC或敲除qseC基因不影響感染后巨噬細(xì)胞活性氧和活性氮的合成。
　　使用iNOS抑制劑L-NMMA和NADPH氧化酶抑制劑DPI預(yù)處理巨噬細(xì)胞，然后對(duì)其進(jìn)行感染，計(jì)數(shù)胞內(nèi)細(xì)菌CFU。結(jié)果顯示，DPI和L-NMMA預(yù)處理后，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細(xì)胞胞內(nèi)活菌數(shù)顯著增多，表明巨噬細(xì)胞對(duì)阻斷QseC或敲除qesC的鼠傷寒沙門氏菌的清除能力降低。
　　在LB培養(yǎng)基中加入外源性過(guò)氧化氫或亞硝酸鈉，每2小時(shí)計(jì)

30、數(shù)細(xì)菌CFU。結(jié)果顯示，在過(guò)氧化氫或亞硝酸鈉的作用下，WT組細(xì)菌的增殖被顯著抑制，而LED209處理組和ΔqesC組的活菌數(shù)與初始菌量相比出現(xiàn)下降趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，阻斷QseC或敲除qesC后，細(xì)菌對(duì)氧和活性氮?dú)牡挚剐燥@著降低，更容易被巨噬細(xì)胞殺死。
　　10. LED209能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌液泡的維持，促進(jìn)胞內(nèi)細(xì)菌與溶酶體融合。氯喹抵抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染早期（2-4小時(shí)），巨噬細(xì)胞內(nèi)三組細(xì)菌在胞質(zhì)中的比例沒(méi)有顯著

31、性差異。但在感染后6-8小時(shí)，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)菌的比例顯著升高，提示阻斷QseC或敲除qseC后抑制胞內(nèi)SCV的維持，使細(xì)菌更易從SCV轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中。
　　為了探討阻斷QseC或敲除qseC抑制胞內(nèi)SCV維持的機(jī)理，我們檢測(cè)了巨噬細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌SCV維持相關(guān)基因sopB和sifA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，阻斷QseC或敲除qseC后，細(xì)菌sopB和sifA的表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果提示，

32、阻斷QseC或敲除qseC后，可能通過(guò)抑制sopB和sifA的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌SCV的維持，抑制細(xì)菌逃逸胞內(nèi)殺菌分子的殺傷。
　　采用溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)溶酶體與細(xì)菌的融合能力。結(jié)果顯示，WT菌株感染組細(xì)菌吸光度一直維持在較低水平，而LED209處理組和ΔqesC菌株感染組的吸光度值在感染后顯著升高。以上結(jié)果表明，WT細(xì)菌能夠抑制溶酶體的融合，阻斷QseC或敲除qseC能夠促進(jìn)胞內(nèi)細(xì)菌與溶酶體融合，利于巨噬細(xì)胞殺傷胞

33、內(nèi)細(xì)菌。
　　11.在感染小鼠體內(nèi)證實(shí)LED209的抗感染保護(hù)作用與抑制巨噬細(xì)胞焦亡和增進(jìn)感染細(xì)菌對(duì)活性氧活性氮敏感性相關(guān)。給予小鼠caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk預(yù)處理后進(jìn)行感染，記錄感染小鼠生存率和生存時(shí)間。結(jié)果顯示，Ac-YVAD-cmk處理后，WT菌株感染組小鼠生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，腹腔巨噬細(xì)胞焦亡率、caspas-1和 IL-1β活化形式的表達(dá)水平以及血清IL-1β的釋放量顯著降低。提示Ac-YVAD-cmk處

34、理通過(guò)抑制炎性復(fù)合體激活，進(jìn)而抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞焦亡，延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間。
　　給予小鼠活性氧和活性氮抑制劑DPI預(yù)處理后進(jìn)行感染，記錄感染小鼠生存率，計(jì)數(shù)臟器CFU。結(jié)果顯示，DPI處理后，LED209處理組和ΔqesC菌株感染組小鼠生存率顯著降低，且肝臟和脾臟荷菌量顯著升高，表明 DPI處理可以減弱 LED209的體內(nèi)抗感染保護(hù)效應(yīng)，提示活性氧和活性氮參與了體內(nèi)阻斷QseC和敲除qseC鼠傷寒沙門氏菌的清除。
　

35、　結(jié)論：
　　1.發(fā)現(xiàn)LED209的體內(nèi)抗感染保護(hù)效應(yīng)主要由巨噬細(xì)胞參與介導(dǎo)。
　　2.發(fā)現(xiàn) LED209通過(guò)阻斷鼠傷寒沙門氏菌 QseC，抑制其鞭毛蛋白基因 flhDC的表達(dá)，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞NLRC4炎性復(fù)合體的活化和巨噬細(xì)胞焦亡的發(fā)生。
　　3.發(fā)現(xiàn) LED209阻斷鼠傷寒沙門氏菌 QseC可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)細(xì)菌，該效應(yīng)與抑制鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi) SCV的維持，促進(jìn)細(xì)菌由 SCV向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)菌與溶酶體融