傷寒沙門菌QseC特性與功能研究.pdf

1、目的:
　　 QseC是大腸桿菌中一個(gè)重要的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)因子,在信號(hào)分子AI-3及腎上腺素／去甲腎上腺素的作用下可以啟動(dòng)一系列基因的表達(dá)?；蚪M序列分析顯示,傷寒沙門菌中存在有qseBC同源基因,本研究擬觀察傷寒沙門菌qseC同源基因的功能及在是否含有葡萄糖條件下對(duì)基因表達(dá)的系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 1.基因缺陷變異株的制備:采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)的同源重組方法,制備傷寒沙門菌qseB、qseC

2、同源基因的單缺陷及qseB／qseC雙缺陷變異株。
　　 2.qseB、qseC基因缺陷回補(bǔ)株的構(gòu)建:PCR擴(kuò)增目的基因,與表達(dá)載體pBAD／gⅢ定向連接后,轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中篩選陽性質(zhì)粒,經(jīng)序列分析鑒定后,轉(zhuǎn)入相應(yīng)的基因缺陷變異株中。
　　 3.生長(zhǎng)曲線的測(cè)定:以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)菌OD600值為縱坐標(biāo)繪制野生株與缺陷株生長(zhǎng)曲線。
　　 4.動(dòng)力試驗(yàn)分析:分別在是否含有0.5％葡萄糖的LB半固體培養(yǎng)基

3、中培養(yǎng)細(xì)菌,觀察野生株及缺陷株的動(dòng)力情況。
　　 5.傷寒沙門菌基因表達(dá)譜分析:分別在是否含有葡萄糖的條件下培養(yǎng)野生株與qseC基因缺陷變異株至OD600值為1.0,收集菌體、提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記熒光(cy3或cy5),與傷寒沙門菌全基因組芯片雜交,雙通道掃描后根據(jù)熒光信號(hào)分析各基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,比較傷寒沙門菌野生株和qseC基因缺陷變異株基因表達(dá)譜差異。
　　 6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分

4、析:選擇基因芯片結(jié)果中部分差異表達(dá)基因,設(shè)計(jì)特異性引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR,驗(yàn)證DNA芯片分析結(jié)果。
　　 7.HeLa細(xì)胞侵襲試驗(yàn):將在含0.5％葡萄糖生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)至OD600為1.0左右的細(xì)菌,加入培養(yǎng)有HeLa細(xì)胞的24孔板中(MOI=20),90 min后收集一部分細(xì)胞,加入裂解液,涂LB平板過夜培養(yǎng),計(jì)細(xì)菌克隆數(shù),代表細(xì)菌粘附細(xì)胞水平T0；另一部分加入慶大霉素殺死胞外細(xì)菌,繼續(xù)培養(yǎng)90 min,破胞后涂板過夜

5、培養(yǎng),計(jì)克隆數(shù)代表細(xì)菌的侵襲水平T90,用T90／T0的值代表細(xì)菌的侵襲力。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)PCR及序列分析證實(shí)qseB、qseC及qseB／qseC基因缺陷變異株中分別缺失了264,690及954個(gè)堿基,表明成功構(gòu)建傷寒沙門菌qseB、qseC及qseB／qseC基因缺陷變異株。
　　 2.PCR及序列分析結(jié)果表明,成功構(gòu)建pBAD-qseB及pBAD-qseC陽性重組載體,并成功將重組載體導(dǎo)入相應(yīng)

6、的缺陷株中,制備成qseB、qseC各基因缺陷回補(bǔ)株。
　　 3.生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明qseC基因缺陷變異株在是否含有葡萄糖條件下生存能力均與野生株相似。在葡萄糖條件下,野生株與缺陷株的生長(zhǎng)均比不加葡萄糖條件下快。
　　 4.動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果顯示,在是否含有葡萄糖情況下,qseC基因缺陷變異株動(dòng)力均比野生株明顯下降,回補(bǔ)qseC基因后動(dòng)力有所恢復(fù)；qseB缺陷變異株與qseB／qseC雙缺陷變異株動(dòng)力與野生株相比均無明顯差異。<

7、br>　　 5.基因芯片分析結(jié)果顯示,在普通條件下,傷寒沙門菌qseC基因缺陷變異株相比野生株,有13個(gè)基因表達(dá)上調(diào),6個(gè)基因表達(dá)下調(diào),主要涉及qseC側(cè)翼基因、酶類基因等；在含葡萄糖條件下,qseC基因缺陷變異株中有26個(gè)基因表達(dá)上調(diào),14個(gè)基因表達(dá)下調(diào),差異表達(dá)基因包括SPI-1相關(guān)基因,qseC側(cè)翼基因,酶類基因等。
　　 6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因表達(dá)差異結(jié)果,一方面進(jìn)一步支持了基因芯片分析結(jié)果,另一方面還顯示Qs