傷寒沙門菌線性質(zhì)粒pBSSB1編碼基因p17的功能研究.pdf

1、目的:
　　線性質(zhì)粒作為有別于環(huán)狀結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的一種特殊質(zhì)粒分子，已成為近年來基礎(chǔ)微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。pBSSB1是目前為止在腸桿菌科中發(fā)現(xiàn)的唯一線性質(zhì)粒，其介導(dǎo)了H:z66陽性傷寒沙門菌鞭毛的單向相變換。經(jīng)生物信息學(xué)分析和預(yù)測，該線性質(zhì)粒上的第17號基因(p17)位于其可能的復(fù)制起始點(diǎn)附近，編碼一相對分子量約27 kDa的蛋白(P17)，可能具有參與調(diào)控線性質(zhì)粒的復(fù)制等作用，然而其確切的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究旨在通過一系列實(shí)

2、驗(yàn)對p17基因進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，分析其可能的生物學(xué)功能。
　　方法:
　　1.重組蛋白P17-His6的表達(dá)及純化:通過PCR、酶切、酶連構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28b(+)-p17。將測序驗(yàn)證的陽性重組質(zhì)粒pET28b(+)-p17導(dǎo)入表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，采用Ni柱親和層析純化重組蛋白P17-His6。
　　2.兔抗重組蛋白P17-His6多克隆抗體的制備:將純化的重組蛋白P17

3、-His6與弗式佐劑研磨至完全乳化后免疫新西蘭大白兔，制備兔抗P17-His6的抗血清并經(jīng)純化后用酶聯(lián)免疫法測定抗體效價，Western-Blot驗(yàn)證抗原與多克隆抗體反應(yīng)的特異性。
　　3.P17蛋白在細(xì)菌不同生長時期的表達(dá)特性分析:培養(yǎng)傷寒沙門菌野生株至不同生長時期（OD600分別為0.2、0.5、0.8、1.2和1.6），分別提取其總蛋白，利用Western-Blot，選用DnaK做內(nèi)參，對P17蛋白在傷寒沙門菌不同生長時期的

4、表達(dá)量進(jìn)行分析。
　　4.p17基因缺陷變異株的制備:利用自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌p17基因缺陷變異株(△p17)。
　　5.p17基因缺陷回補(bǔ)株的制備:將p17基因定向連接質(zhì)粒pBAD/gⅢ形成重組質(zhì)粒pBAD/gⅢ-p17，分別將重組質(zhì)粒pBAD/gⅢ-p17和pBAD/gⅢ空質(zhì)粒導(dǎo)入p17基因缺陷變異株，構(gòu)建p17基因的缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)?；匮a(bǔ)對照株。
　　6.p17基因高表達(dá)株的制備

5、:將p17基因定向連接質(zhì)粒pB AD/Myc-HisA形成重組質(zhì)粒pB AD/Myc-HisA-p17，分別將重組質(zhì)粒和pB AD/Myc-HisA空質(zhì)粒導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，構(gòu)建p17基因的高表達(dá)株和空質(zhì)粒對照株。
　　7.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將野生株和p17基因缺陷變異株培養(yǎng)OD600至0.4后，加入含有HeLa細(xì)胞的24孔板中（MOI為20∶1）。培養(yǎng)90 min后取部分孔進(jìn)行細(xì)胞破膜，收集菌體后涂板，長出的菌落數(shù)標(biāo)記為T0（代表

6、細(xì)菌粘附細(xì)胞能力）;剩余孔的細(xì)胞加入慶大霉素后繼續(xù)培養(yǎng)90 min后，破膜后涂板，將長出的菌落數(shù)標(biāo)記為T90（代表細(xì)菌侵襲能力），細(xì)菌的侵襲能力以T90/T0值表示。
　　8.動力試驗(yàn):將野生株、p17基因缺陷變異株、p17基因缺陷回補(bǔ)株、p17高表達(dá)株和空質(zhì)粒對照株培養(yǎng)至對數(shù)期，各取2.0μL點(diǎn)樣到0.3％的半固體平板，37℃培養(yǎng)一定時間后測量動力圈直徑，比較各菌株的動力差異。
　　9.生長曲線測定:將野生株、p17基因缺

7、陷變異株、p17缺陷回補(bǔ)株、回補(bǔ)空質(zhì)粒對照株、p17高表達(dá)株及其空質(zhì)粒對照株在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每1h測定一次OD600值。同時，將p17基因連接到質(zhì)粒載體pET28b(+)上分別導(dǎo)入E.coli DH5α和E.coli BL21，并測定這兩種變異菌株的生長曲線。
　　10.p17基因的缺失對細(xì)菌全局基因表達(dá)的影響:利用基因芯片技術(shù)，分析p17基因缺陷后細(xì)菌全局基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。取傷寒沙門菌野生株及其相應(yīng)的p17基因缺陷株于

8、普通液體LB中培養(yǎng)4h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA同時互標(biāo)熒光素，與傷寒沙門菌基因組DNA芯片雜交后掃描，熒光信號數(shù)據(jù)化處理以比較兩菌株的基因表達(dá)譜差異。選取部分具有代表性的差異表達(dá)基因，利用qRT-PCR分析其在p17基因缺陷株和野生株間的表達(dá)差異，以驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.重組蛋白P17-His6的表達(dá)及純化:最終測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28b(+)-p17，成功將重組質(zhì)粒pET28b(+)-

9、p17導(dǎo)入表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)，Ni柱親和層析純化獲得的蛋白用SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示獲得了高純度的重組蛋白P17-His6。
　　2.兔抗P17-His6多克隆抗體的制備:獲得的多克隆抗體用酶聯(lián)免疫法測定其抗體效價＞1∶128×103，Western-Blot顯示抗原與多克隆抗體反應(yīng)的特異性良好。
　　3.P17蛋白在不同生長時期的表達(dá)特性分析:Western-Blot結(jié)果顯示傷寒沙門菌P17蛋白表達(dá)

10、量在遲滯期到對數(shù)期過程中不斷增高，在對數(shù)期表達(dá)量最高，對數(shù)期過后其表達(dá)量逐漸降低。
　　4.p17基因缺陷變異株的制備:PCR、酶切驗(yàn)證和測序結(jié)果顯示重組自殺質(zhì)粒pGMB151-p17構(gòu)建成功，重組自殺質(zhì)粒成功導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，經(jīng)同源重組后篩選到了p17基因缺陷變異株，其能穩(wěn)定傳代，成功制備了傷寒沙門菌p17基因缺陷變異株。
　　5.p17基因缺陷回補(bǔ)株的制備:PCR、酶切驗(yàn)證和測序分析顯示成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBAD/g

11、Ⅲ-p17，將重組質(zhì)粒和pBAD/gⅢ空質(zhì)粒分別導(dǎo)入p17基因缺陷變異株，PCR、酶切驗(yàn)證表明p17基因的缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒回補(bǔ)對照株制備成功。
　　6.p17基因高表達(dá)株的制備:PCR、酶切驗(yàn)證和測序分析顯示p17基因成功定向連接質(zhì)粒pB AD/Myc-HisA，形成重組質(zhì)粒pB AD/Myc-HisA-p17，將重組質(zhì)粒和pB AD/Myc-HisA空質(zhì)粒分別導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，PCR、酶切顯示p17基因的高表達(dá)株和高表達(dá)空

12、質(zhì)粒對照株構(gòu)建成功。
　　7.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):p17基因缺陷菌株的侵襲水平略高于野生株，但是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果表明p17的表達(dá)差異對傷寒沙門菌的侵襲力影響作用不明顯。
　　8.動力試驗(yàn):p17缺陷株動力明顯低于野生株，回補(bǔ)株與空質(zhì)?；匮a(bǔ)對照株相比動力增強(qiáng)，p17基因高表達(dá)株的動力高于空質(zhì)粒高表達(dá)株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　9.生長曲線測定:p17基因缺陷變異株的生長速度明顯遲緩于野生株(

13、P＜0.05)，且回補(bǔ)p17之后生長速度有明顯改善，另外高表達(dá)菌株生長速度明顯快于空載體對照株，結(jié)果表明p17基因的表達(dá)影響傷寒沙門菌的生長。除此之外，攜帶p17基因的大腸桿菌的生長速度明顯快于空載體對照株。
　　10.p17基因的缺失對細(xì)菌全局基因表達(dá)的影響:與野生株相比，p17基因缺陷株中共有334個基因表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中57個基因表達(dá)上調(diào)，134個基因表達(dá)下調(diào)，主要為代謝、侵襲、鞭毛相關(guān)基因。部分差異表達(dá)基因經(jīng)qRT-P

14、CR分析，結(jié)果與基因芯片的分析結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　本研究證實(shí)了S.Typhi的P17蛋白的存在，成功獲得了高純度的重組蛋白P17-His6，并制備了抗P17多克隆抗體，P17蛋白的表達(dá)在遲滯期到對數(shù)期過程中不斷增高，在對數(shù)期表達(dá)量最高，對數(shù)期過后其表達(dá)量逐漸降低。p17基因的表達(dá)雖然不影響細(xì)菌對上皮細(xì)胞的侵襲力，但可以增強(qiáng)傷寒沙門菌的動力，p17基因不僅可以促進(jìn)傷寒沙門菌的生長，而且在大腸桿菌中也起到促生長作用。基因