鼠傷寒沙門(mén)菌分離株耐藥性和其質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因研究.pdf

1、鼠傷寒沙門(mén)菌是一種重要的人獸共患病原菌，特別在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家?guī)缀趺磕甓加猩⒃诒┌l(fā)的報(bào)道。鼠傷寒沙門(mén)菌來(lái)源廣泛，可在人和動(dòng)物之間通過(guò)食物鏈發(fā)生交叉感染?？咕幬锏氖褂檬欠乐紊抽T(mén)菌病的重要措施，但由于其不合理使用導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性不斷增強(qiáng)，并出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象。此外，耐藥基因的傳播也是耐藥菌株不斷出現(xiàn)的原因之一。耐藥基因通常位于可移動(dòng)元件上，攜帶耐藥決定因子的質(zhì)粒是傳播耐藥性的重要因素。由此帶來(lái)的耐藥問(wèn)題、食品安全問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重

2、。而目前國(guó)內(nèi)關(guān)于鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥分布情況及其質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的研究相對(duì)較少。
　　本研究以330株鼠傷寒沙門(mén)菌為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定這些菌株對(duì)18種抗菌藥物的最小抑菌濃度，分析不同來(lái)源的鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥特性和多重耐藥狀況;調(diào)查質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因(PMQR)在鼠傷寒沙門(mén)菌中的流行和分布情況;通過(guò)質(zhì)粒接合試驗(yàn)獲得新型多粘菌素耐藥基因mcr-1陽(yáng)性接合子，并對(duì)供受體菌及接合子進(jìn)行氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、苯丙醇類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、磺

3、胺類(lèi)、硝基呋喃類(lèi)、喹噁啉類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)藥物的敏感性試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)各種抗菌藥物的影響。本研究將有助于進(jìn)一步了解鼠傷寒沙門(mén)菌分離株耐藥流行狀況、耐藥特點(diǎn)及其質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的分布。
　　1.不同來(lái)源鼠傷寒沙門(mén)菌分離株耐藥性測(cè)定與分析
　　本研究對(duì)330株不同來(lái)源的鼠傷寒沙門(mén)菌最小抑菌濃度(MIC)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示其對(duì)阿莫西林/克拉維酸的耐藥率最高，達(dá)到75.8％，其次為四環(huán)素(73.9％)、氨芐西林(73.6％);對(duì)鏈霉素、氯霉

4、素、頭孢唑啉、萘啶酸、復(fù)方新諾明和多粘菌素E的耐藥率均在50％以上;對(duì)氨曲南、卡那霉素、慶大霉素、恩諾沙星和喹乙醇的耐藥率分布在20.1％-38.8％之間;環(huán)丙沙星和呋喃妥因的體外抑菌效果較好，耐藥率均未達(dá)到10％;而美羅培南和阿米卡星的體外抑菌效果最好，幾乎沒(méi)有耐藥菌株出現(xiàn)。
　　鼠傷寒沙門(mén)菌分離株主要來(lái)源于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)（豬場(chǎng)）、屠宰環(huán)節(jié)（屠宰場(chǎng)）、市場(chǎng)環(huán)節(jié)（農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）和人，因此對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示不同環(huán)節(jié)

5、的鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、四環(huán)素、氨芐西林、氯霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、美羅培南和呋喃妥因的耐藥性相似。而對(duì)余下的8種抗菌藥物，其耐藥性表現(xiàn)差異較大。對(duì)于同一個(gè)環(huán)節(jié)而言，鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)各抗菌藥物的耐藥性與本研究中菌株的總體耐藥情況較為相似，其中養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中鼠傷寒沙門(mén)菌的耐藥率較其他三個(gè)環(huán)節(jié)都高，其次是市場(chǎng)環(huán)節(jié)，屠宰環(huán)節(jié)菌株的耐藥率與人源菌株較為相似。
　　鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥現(xiàn)象較為普遍。其中有260株分離株對(duì)3

6、類(lèi)及以上抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，多重耐藥率達(dá)83.9％(260/310)。多重耐藥的優(yōu)勢(shì)表型為氨芐西林-可莫西林/克拉維酸-鏈霉素-四環(huán)素-復(fù)方新諾明-氯霉素-多粘菌素E。市場(chǎng)銷(xiāo)售環(huán)節(jié)中鼠傷寒沙門(mén)菌多重耐藥現(xiàn)象最為嚴(yán)重(100％)，養(yǎng)殖和人環(huán)節(jié)次之，多重耐藥率分別為99.0％和76.1％，屠宰環(huán)節(jié)多重耐藥率最低為72.3％。
　　對(duì)2014-2016年間在定點(diǎn)豬場(chǎng)收集的鼠傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，定點(diǎn)豬場(chǎng)鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)各抗菌藥物

7、的MICmm、MIC50值要普遍高于本研究中鼠傷寒沙門(mén)菌總體統(tǒng)計(jì)狀況，說(shuō)明該定點(diǎn)豬場(chǎng)中鼠傷寒沙門(mén)菌在這段時(shí)間耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。
　　2.鼠傷寒沙門(mén)菌分離株中PMQR基因的流行和分布情況
　　本研究對(duì)330株不同源鼠傷寒沙門(mén)菌中PMQR基因進(jìn)行檢測(cè)，PMQR基因的陽(yáng)性率高達(dá)51.2％。在所有的PMQR基因中，oqxAB陽(yáng)性率最高，為29.7％; aac(6')-Ⅰb-cr和qnrS的陽(yáng)性率次之（19.4％和10.9％），未檢測(cè)

8、到qnrA、qnrC和qnrD基因。oqxAB的陽(yáng)性率顯著高于其它PMQR基因，尤其是在豬源分離株中。
　　通過(guò)對(duì)qnr基因陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序，確定了其基因亞型。在本研究中，共測(cè)出qnrB基因亞型2種，分別為qnrB4和qnrB26; qnrS基因亞型也為2種，分別為qnrS1和qnrS2。雙陽(yáng)性的菌株中qnrS+aac(6')-b-cr和oqxAB+aac(6')-b-cr共同存在的現(xiàn)象最為常見(jiàn)，分別占9.6％和9.9％。對(duì)PMQ

9、R陽(yáng)性菌株的基因型和表型相關(guān)性分析顯示:對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的鼠傷寒沙門(mén)菌中，攜帶有PMQR基因的菌株占73.6％;幾乎所有攜帶PMQR基因的表型敏感性菌株對(duì)環(huán)丙沙星敏感性下降（DCS，decreased ciprofloxacin susceptibility），所對(duì)應(yīng)的MIC值的范圍在0.12-1μg/mL之間。oqxAB陽(yáng)性菌株對(duì)喹乙醇的MIC值結(jié)果顯示，有90.0％的oqxAB陽(yáng)性菌株對(duì)喹乙醇表現(xiàn)耐藥或者中介，88.6％的oqxA

10、B陰性菌株對(duì)喹乙醇表現(xiàn)敏感或者中介，說(shuō)明330株鼠傷寒沙門(mén)菌的基因型與喹乙醇的耐藥表型基本對(duì)應(yīng)。
　　3.鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的新型多粘菌素耐藥基因mcr-1的初步研究
　　應(yīng)用PCR方法對(duì)新型質(zhì)粒介導(dǎo)的多粘菌素耐藥基因mcr-1進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)330株鼠傷寒沙門(mén)菌中，僅一株菌含有此基因。通過(guò)對(duì)該mcr-1陽(yáng)性菌株的全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該鼠傷寒沙門(mén)菌全長(zhǎng)5，232，290 bp，GC含量為51.4％，多位點(diǎn)序列型為S

11、T34。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌基因組中含有IncHI2、IncX1、IncI2、IncHI2A和IncQ1共5個(gè)復(fù)制子，提示其可能攜帶不止一個(gè)質(zhì)粒，且mcr-1基因位于其中一個(gè)質(zhì)粒上;通過(guò)質(zhì)粒接合試驗(yàn)，獲得1株mcr-1陽(yáng)性接合子。
　　藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該接合子對(duì)多粘菌素E和鏈霉素表現(xiàn)耐藥，所對(duì)應(yīng)的MIC值分別為8μg/mL和64μg/mL，與受體菌相比，分別升高了16倍和64倍。接合子對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星和萘啶酸的敏感性出