傷寒沙門菌fljA樣基因的功能研究.pdf

1、目的：長(zhǎng)期以來(lái)人們都認(rèn)為傷寒沙門菌為單相菌株，即只有Ⅰ相鞭毛素編碼基因fliC，最近在z66陽(yáng)性傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)了有兩種鞭毛素編碼基因，z66抗原編碼基因(fljB：z66)和fliC，在z66抗原編碼基因后存在一基因，與Ⅱ相鞭毛素編碼基因簇中的fljA相似，本文目的是通過(guò)研究該fljA樣基因?qū)抽T菌鞭毛素基因fliC的表達(dá)調(diào)節(jié)作用以認(rèn)識(shí)其功能。 方法：(1)分泌蛋白和菌體蛋白分析利用三氯醋酸—丙酮法提取傷寒沙門菌野生株(G

2、IFU10007)，fljA樣基因缺陷株(Wt△fljA)和抗體誘導(dǎo)菌株(007j+)分泌蛋白，用SDS—PAGE電泳鑒定，并用Western免疫印跡分析分泌蛋白和菌體蛋白；(2)fljA樣基因的表達(dá)根據(jù)fljA樣基因兩端序列設(shè)計(jì)引物，以z66抗原陽(yáng)性傷寒沙門菌基因組為模板，通過(guò)PCR獲得該基因，與表達(dá)載體pBAD/gⅢ連接后，重組體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中誘導(dǎo)培養(yǎng)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入傷寒沙門菌j+菌株，用L—阿拉伯糖誘導(dǎo)fljA樣基因的表達(dá)；

3、(3)fliC基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR觀察fljC樣基因?qū)liC轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)；(4)fliC：：lacZ變異株的制備采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌β—半乳糖苷酶插入變異株fliC：：lacZ，設(shè)計(jì)加KpnⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物，用PCR擴(kuò)增獲得fliC基因的上、下游同源性DNA片段，并與用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV—β—galactosidasevector的片段(無(wú)啟動(dòng)子的lacZ

4、片段)定向連接，克隆至自殺質(zhì)粒pGMB151的SmaⅠ，再通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入傷寒沙門菌j+株，在含X—Gal的蔗糖平板上篩選獲得同源重組變異株fliC：：lacZ，此菌株為翻譯融合菌株；(5)fliC基因翻譯水平表達(dá)分析通過(guò)測(cè)定β—半乳糖苷酶LacZ的活性來(lái)觀察fljA樣基因?qū)liC翻譯水平的表達(dá)調(diào)節(jié)。 結(jié)果：(1)用SDS—PAGE電泳及Western免疫印跡鑒定分析分泌蛋白和菌體蛋白發(fā)現(xiàn)野生株GIFU10007表達(dá)FljB：z

5、66，抗體誘導(dǎo)菌007j+表達(dá)FliC：j，而fljA樣基因缺陷株(WtΔfljA)同時(shí)表達(dá)FljB：z66和FliC：j。(2)PCR及序列分析證實(shí)，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pBADfljA，用0.2％的L—阿拉伯糖誘導(dǎo)了FljA融合蛋白的表達(dá)。把空載體pBAD/gⅢ和表達(dá)載體pBADfljA導(dǎo)入007j+，Western免疫印跡發(fā)現(xiàn)含有空載體的007j+與007j+菌的FliC：j表達(dá)沒(méi)有明顯差異，而含有表達(dá)載體的007j+菌幾乎不表達(dá)F

6、liC：j。(3)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR測(cè)定，發(fā)現(xiàn)含有表達(dá)載體的007j+菌株的fliC mRNA比007j+菌株降低了7倍左右。(4)PCR及序列分析證實(shí)變異株中fliC基因中間部分被3550bp的lacZ片段替代，表明成功構(gòu)建了j抗原陽(yáng)性fliC基因的lacZ插入變異株007j+(fliC：：lacZ)。(5)通過(guò)β—半乳糖苷酶測(cè)定，發(fā)現(xiàn)含有表達(dá)載體的007j+(fliC：：lacZ)變異株的β—半乳糖苷酶活性比007j+(f