傷寒沙門菌非編碼RNA AsrH驗證與表型研究.pdf

1、目的：
　　近來，本研究組通過對傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi， S. Typhi）轉錄組的分析，新發(fā)現了很多非編碼RNA(non-coding RNA， ncRNA)，其中有一可能為rpoH基因對側編碼的ncRNA，稱為AsrH，本論文擬進行AsrH表達鑒定和分子特性分析，觀察其在S. Typhi中的作用。
　　方法：
　　1.AsrH的鑒定：通過Northern Bl

2、ot證實AsrH在S. Typhi中的存在性，并通過Northern Blot和qRT-PCR觀察其生長時相的表達特性。
　　2.AsrH的分子全長鑒定：通過5′RACE、Tiling PCR來找出AsrH的轉錄起始點、可能的轉錄終止點，測出AsrH分子的大概全長。
　　3.基因缺陷變異株的制備：通過自殺質粒pGMB151介導構建S. Typhi asrH基因啟動子缺陷變異株。
　　4. asrH變異株的半定量驗證：用

3、RT-PCR分析S. Typhi野生株（簡稱“WT”）和asrH變異株中asrH和rpoH的表達情況。
　　5.生長曲線測定：描制生長曲線，觀察WT、asrH基因啟動子缺陷株在四種不同環(huán)境下（等滲、高滲應激、氧應激、酸應激）時的生存情況。
　　6.動力試驗：半固體動力培養(yǎng)板（0.3％）上培養(yǎng)細菌，觀察比較asrH啟動子缺陷變異株、WT的動力情況。
　　7.生物膜形成試驗：生物膜結晶紫染色觀察asrH啟動子缺陷變異株、W

4、T的生物膜形成情況。
　　結果：
　　1.Northern blot與qRT-PCR表明AsrH在S. Typhi中確實存在，而且在生長對數晚期（OD600＝1.2）的時候表達量最高。
　　2.經過5′RACE和Tiling PCR分析，推斷AsrH分子全長在846bp-1007bp之間，轉錄起始點位于rpoH基因終止碼下游119bp，轉錄方向相反，能覆蓋大部分的rpoH基因編碼區(qū)，中間沒有完整的ORF結構，因此Asr

5、H為一長非編碼RNA。
　　3.自殺質粒pGMB151介導敲制asrH基因啟動子區(qū)域缺失120bp的變異株。
　　4.在asrH缺陷株中asrH基因不表達，rpoH基因正常表達。在WT中asrH和rpoH基因兩者都表達。
　　5.生長曲線顯示，在一定時間內，與WT相比，酸、高滲應激下asrH缺陷株的生存能力顯著降低，而在氧應激下則相反。
　　6.動力試驗顯示，與WT相比，asrH啟動子缺陷株的動力幾乎完全喪失。7