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文檔簡介
1、目的:
近來,本研究組通過對傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S. Typhi)轉錄組的分析,新發(fā)現了很多非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA),其中有一可能為rpoH基因對側編碼的ncRNA,稱為AsrH,本論文擬進行AsrH表達鑒定和分子特性分析,觀察其在S. Typhi中的作用。
方法:
1.AsrH的鑒定:通過Northern Bl
2、ot證實AsrH在S. Typhi中的存在性,并通過Northern Blot和qRT-PCR觀察其生長時相的表達特性。
2.AsrH的分子全長鑒定:通過5′RACE、Tiling PCR來找出AsrH的轉錄起始點、可能的轉錄終止點,測出AsrH分子的大概全長。
3.基因缺陷變異株的制備:通過自殺質粒pGMB151介導構建S. Typhi asrH基因啟動子缺陷變異株。
4. asrH變異株的半定量驗證:用
3、RT-PCR分析S. Typhi野生株(簡稱“WT”)和asrH變異株中asrH和rpoH的表達情況。
5.生長曲線測定:描制生長曲線,觀察WT、asrH基因啟動子缺陷株在四種不同環(huán)境下(等滲、高滲應激、氧應激、酸應激)時的生存情況。
6.動力試驗:半固體動力培養(yǎng)板(0.3%)上培養(yǎng)細菌,觀察比較asrH啟動子缺陷變異株、WT的動力情況。
7.生物膜形成試驗:生物膜結晶紫染色觀察asrH啟動子缺陷變異株、W
4、T的生物膜形成情況。
結果:
1.Northern blot與qRT-PCR表明AsrH在S. Typhi中確實存在,而且在生長對數晚期(OD600=1.2)的時候表達量最高。
2.經過5′RACE和Tiling PCR分析,推斷AsrH分子全長在846bp-1007bp之間,轉錄起始點位于rpoH基因終止碼下游119bp,轉錄方向相反,能覆蓋大部分的rpoH基因編碼區(qū),中間沒有完整的ORF結構,因此Asr
5、H為一長非編碼RNA。
3.自殺質粒pGMB151介導敲制asrH基因啟動子區(qū)域缺失120bp的變異株。
4.在asrH缺陷株中asrH基因不表達,rpoH基因正常表達。在WT中asrH和rpoH基因兩者都表達。
5.生長曲線顯示,在一定時間內,與WT相比,酸、高滲應激下asrH缺陷株的生存能力顯著降低,而在氧應激下則相反。
6.動力試驗顯示,與WT相比,asrH啟動子缺陷株的動力幾乎完全喪失。7
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