傷寒沙門菌非編碼RNA S527表達特性與作用研究.pdf

1、目的:
　　近來通過生物學預測方法以及計算機分析等實驗手段，已在細菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了許多非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，它們可作為重要的調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控細菌的基因表達。本課題組通過利用傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)轉錄組深度測序及生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了一系列疑似ncRNA，本研究將對其中之一疑似ncRNAS527進行分子鑒定、表達特性分析

2、及作用與功能等研究。
　　方法:
　　1.S527分子鑒定:通過northern blot實驗證實S527在S.Typhi有表達;利用5' RACE和Tiling PCR的方法，分析S527基因的轉錄起始點以及可能的轉錄終止點，確定其基因位置和分子的全長。
　　2.S527的表達特性分析:采用northern blot和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗，分析S.Typhi在不同生長時相和酸、氧、高滲環(huán)境應激后的

3、S527表達變化。
　　3.S527基因缺陷變異株的制備:利用λ-Red同源重組方法，制備的(114bp)缺失變異株。
　　4.S527高表達株的制備:構建含S527基因全長的高表達重組載體pBAD-S527，導入S.Typhi作為S527高表達菌株。
　　5.S527作用分析:將野生株、變異株、高表達菌株及空質粒對照株在LB中及酸、氧和高滲條件下培養(yǎng)，分別測OD600，繪制生長曲線，觀察S527對S.Typhi生長的

4、影響;將對數(shù)生長期的各菌株，接種至含0.3％瓊脂糖的LB動力平板中，37℃過夜培養(yǎng)，測量菌株圈直徑，分析S527對S.Typhi動力的影響。
　　結果:
　　1.Northern blot結果顯示，S.Typhi野生株中有與S527特異性cDNA探針結合的RNA，長約700-800nt，表明S527在S.Typhi確有表達;5'RACE結果顯示，S527基因的轉錄起始點位于ribE基因翻譯轉錄終止點下游963nt處;Tili

5、ng PCR結果顯示，S527基因的終止區(qū)位于基因下游755-817bp之間，期間無明顯的蛋白編碼ORF結構。
　　2.Northern blot和qRT-PCR實驗顯示，S527在S.Typhi的對數(shù)中后期(OD6000.8)表達最高，在酸、氧及高滲應激下表達下調(diào)。
　　3.S527基因序列分析顯示，S527基因中114bp被卡那霉素抗性基因替代，表明S527基因缺陷株制備成功。
　　4.生長曲線表明，S527缺陷株

6、在各種應激下生長能力較野生株低，但在酸應激8小時后S527缺陷株生長能力逐漸恢復。S527高表達株較野生株及空質粒對照株的生長能力稍低，但無顯著差異。
　　5.動力實驗結果顯示，S527高表達菌株動力較野生株及空質粒對照株動力明顯增高。
　　結論:
　　1.S527為一長鏈ncRNA，在S.Typhi確有表達，且對數(shù)中后期表達最高;環(huán)境應激可影響S527的表達。
　　2.S527基因缺陷可影響S.Typhi的生長