傷寒沙門菌質粒對巨噬細胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應的影響.pdf

1、目的：
　　通過建立傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.typhi）感染的細胞模型，用自噬阻斷劑氯喹（chloroquine，CQ）和Beclin1過表達技術，研究傷寒沙門菌質粒pRST98對人巨噬細胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應的影響，為進一步闡明該質粒增強宿主菌毒力的分子機制提供理論和實驗依據。
　　方法：
　　一、傷寒沙門菌質粒對巨噬細胞THP-1自噬過程的影響<

2、br>　　1. CQ對THP-1細胞自噬阻斷濃度的確定
　　CQ是一種治療瘧疾的藥物，近年來被廣泛用作自噬阻斷劑，它通過提高溶酶體的pH值使酸性水解酶失活，導致自噬溶酶體無法分解底物，造成自噬相關蛋白的累積。本實驗以0、10、20、30、40、50、60、70和80μM CQ的培養(yǎng)液作用THP-1細胞6 h，用蛋白質印跡技術（western blot，WB）檢測自噬底物蛋白p62的累積水平；作用細胞24 h后，用噻唑藍還原法（me

3、thyl thiazolyl tetrazolium， MTT）檢測細胞存活率。
　　2. CQ對受試菌的影響
　　用上述方法測定的CQ適宜濃度作用受試菌24 h，OD600測定菌液濃度，檢測該濃度CQ對細菌的影響。
　　3. CQ對THP-1細胞感染模型自噬的影響
　　由于傷寒沙門菌只感染人類的嚴格宿主特異性，本實驗以攜帶傷寒沙門菌質粒pRST98的野生株ST8、消除pRST98的突變株ST8-ΔpRST98和

4、將pRST98經接合轉移重新導入的回補株 ST8-c-pRST98為受試菌，分別與人巨噬細胞 THP-1共培養(yǎng)建立感染模型。用對數(shù)生長期細菌按感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）50:1感染細胞，同時設立自噬阻斷劑CQ干預組。將細菌與細胞共作用1 h后吸取上清，加入含100μg/ml的阿米卡星（amikacin，AMK）培養(yǎng)液作用2 h以去除胞外菌，將AMK濃度降為10μg/ml以抑制從感染細胞中釋放至

5、培養(yǎng)液中的細菌生長。分別在感染的1 h和3 h收獲細胞：①WB檢測細胞自噬標志蛋白——微管相關蛋白1輕鏈3-II（microtubule-associated protein1 light chain3-II，MAP1-LC3-II）及自噬底物蛋白p62表達；②將帶有紅色和綠色熒光的mRFP-GFP-LC3質粒轉染THP-1細胞后，用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀

6、察細胞自噬體及自噬溶酶體的變化。
　　二、傷寒沙門菌質粒對巨噬細胞THP-1凋亡和炎癥反應的影響
　　beclin1基因是第一個被確認的哺乳動物自噬調控基因，其編碼產物Beclin1是自噬發(fā)生的標志蛋白。本部分實驗用脂質體轉染法將外源性 beclin1基因導入THP-1細胞，研究Beclin l蛋白過表達后傷寒沙門菌質粒對巨噬細胞凋亡及炎癥反應的影響。感染模型建立同第一部分，分別設野生株ST8、突變株ST8-ΔpRST98和

7、回補株ST8-c-pRST98感染的Beclin1過表達組及對照組，共6組。在感染后1 h、3 h、5 h、9 h和13 h收獲細胞：① WB檢測質粒轉染后Beclin1表達效率；②Annexin.V-FITC/Propidium Iodide（Ann.V/PI）雙染流式細胞術（flow cytometry， FCM）分析細胞凋亡率；③酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢

8、測細胞因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）和白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）。
　　結果：
　　一、傷寒沙門菌質粒對巨噬細胞THP-1自噬過程的影響
　　1. WB檢測自噬底物蛋白p62結果顯示，30μM CQ作用THP-1細胞6 h后， p62已出現(xiàn)明顯累積（p<0.01），40μM CQ作用細胞6

9、h后，累積程度達到飽和。MTT法檢測結果顯示，30μM和40μM CQ作用細胞24 h后，存活率分別為58.58%和46.03%。
　　2. OD600測定菌液濃度結果顯示，與對照組相比，30μM CQ對3株受試菌菌量未見明顯影響。參照文獻，30μM CQ作用THP-1細胞6 h，自噬底物蛋白p62出現(xiàn)明顯累積，作用細胞24 h后，細胞存活率超過50%，且對細菌未見明顯影響，因此將30μM作為CQ的后續(xù)工作濃度。
　　3.

10、WB檢測自噬標志蛋白LC3-Ⅱ和底物蛋白p62結果顯示，細菌與細胞共作用1 h，CQ干預組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值明顯高于對照組（p<0.01），其中突變株ST8-ΔpRST98 LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值的增加量均高于野生株ST8及回補株 ST8-c-pRST98（p<0.05）。細菌與細胞共作用3 h， CQ干預組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值較對照組

11、上升（p<0.05），但突變株ST8-ΔpRST98的上升量仍顯著高于野生株ST8及回補株ST8-c-pRST98（p<0.01）。
　　4.用mRFP-GFP-LC3質粒轉染THP-1細胞后，CLSM檢測結果顯示，細菌與細胞共作用1 h，CQ干預組突變株ST8-ΔpRST98感染細胞的點狀聚集物數(shù)量高于對照組，而野生株 ST8和回補株 ST8-c-pRST98感染細胞中未見顯著差異。細菌與細胞共作用3 h，CQ干預組3株菌感染細

12、胞的點狀聚集物數(shù)量均高于對照組，其中突變株ST8-ΔpRST98的上升量顯著高于野生株ST8及回補株ST8-c-pRST98（p<0.01）。
　　二、傷寒沙門菌質粒對巨噬細胞THP-1凋亡和炎癥反應的影響
　　1. FCM檢測細胞凋亡率結果顯示，Beclin1蛋白過表達組，在細菌與細胞共作用的1 h、3 h、5 h和9 h，野生株ST8、回補株ST8-c-pRST98及突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細胞的凋亡率

13、均上升；細菌與細胞共作用13 h，野生株、回補株與突變株感染THP-1的凋亡率未見顯著性差異。對照組在細菌與細胞共作用的1 h和3 h，凋亡率未見顯著差異。細菌與細胞共作用5 h、9 h和13 h，突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細胞凋亡率低于野生株ST8和回補株ST8-c-pRST98感染組（p<0.05），且隨時間延長愈加明顯。
　　2. ELISA檢測細胞因子結果顯示，細菌和細胞共作用1 h、3 h和5 h，Bec

14、lin1過表達組及對照組突變株感染細胞的IL-1β及IL-18表達水平高于野生株和回補株（p<0.05），而突變株感染細胞的IL-10表達水平低于野生株和回補株（p<0.05）。但細菌與細胞共作用9 h后，野生株、回補株與突變株感染細胞的 IL-1β、IL-18和IL-10表達水平未見顯著差異。細菌和細胞共作用1 h、3 h和5 h，Beclin1蛋白過表達組較對照組3株受試菌感染THP-1細胞的IL-1β及IL-18表達水平上升，而I

15、L-10表達水平下降。細菌與細胞共作用9 h，3株受試菌感染THP-1細胞IL-1β、IL-18和IL-10表達水平未見顯著差異。
　　結論：
　　1. CQ干預前后，比較THP-1細胞自噬過程中自噬標志蛋白LC3-Ⅱ、底物蛋白p62、自噬體和自噬溶酶體的實驗結果顯示，傷寒沙門菌質粒pRST98作用在THP-1細胞自噬過程的前期，早于溶酶體降解的過程。
　　2. Beclin1作為自噬標志蛋白，過表達后可上調沙門菌感染