肝癌細(xì)胞中miR-32表達(dá)及其對(duì)抑癌基因ADAMTS9調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　許多微小RNA(microRNAs，miRNAs)在原發(fā)性肝癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)中表達(dá)異常，提示miRNAs有可能影響肝癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解聯(lián)蛋白金屬蛋白酶9（a disintegrin and metallo-proteinase with thrombospondin motifs-9， ADAMTS9)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，它在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起

2、重要作用。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)的方法研究人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、Huh7、HepG2中miR-32的表達(dá)豐度，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)探討miR-32是否對(duì)ADAMTS9具有調(diào)控作用，從而評(píng)價(jià)miR-32與ADAMTS9在肝癌細(xì)胞中的作用，這將為進(jìn)一步研究肝癌的發(fā)病機(jī)制拓展新的思路，并在肝癌

3、的早期診治及生物治療中擁有廣泛的應(yīng)用前景。
　　材料和方法:
　　1、材料及試劑
　　人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院上海細(xì)胞庫(kù)，人肝癌細(xì)胞株Huh7、人肝癌細(xì)胞株HepG2及人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞株來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室；miR-32過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和雙熒光素酶報(bào)告基因3’UTR質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建合成； miR-32-5p inhibitor/NC由廣州銳博生物有限公司合成。

4、>　　所用主要試劑有：DMEM高糖（Hyclone），RPMI1640（Gibco）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（四季青）；胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）（Solarbio）；青鏈霉素混合液（100x）（雙抗 Solarbio）；lipofectamine2000（invitrogen）；總RNA提取試劑（上海捷瑞公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒（Promega）；逆轉(zhuǎn)錄引物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（In

5、vitrogen公司）。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721、人肝癌細(xì)胞株 Huh7、人肝癌細(xì)胞株HepG2及人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞株分別以含10％胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),每2-3天使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代,取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3、總RNA提取
　　將細(xì)胞用PBS漂洗2次后加入4℃預(yù)冷的

6、Trizol lml，冰上放置5min，加入氯仿200ul，劇烈晃動(dòng)EP管約15s，冰上放置10min后4℃，8800rpm離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml RNase-free EP管中，加入0.5ml異丙醇，-20℃放置10min后4℃，8800rpm離心15min，用75％乙醇漂洗一次，再次離心后將乙醇晾干，用20ul滅菌DEPC水溶解沉淀的RNA過(guò)夜。用紫外分光光度計(jì)讀取OD260/OD280，-80℃保存?zhèn)溆谩?b

7、r>　　4、qRT-PCR檢測(cè)
　　（1）RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：檢測(cè) miR-32的表達(dá)時(shí)，向總 RNA中加入miR-32特異性莖環(huán)引物:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACT GCAACTT-3’；檢測(cè)ADAMTS9 mRNA表達(dá)時(shí)，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機(jī)引物。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，設(shè)置反應(yīng)條件為25℃5min，42℃60min，70℃15min，4℃+∞。

8、(2)qRT-PCR：按照 qRT-PCR試劑盒配制20uL反應(yīng)體系， miR-32上游引物為：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；下游引物為：5’-GCCGCTATTGCA CATTACTAAGTT-3’， ADAMT9上游引物為：5’-CATAATGAACAGGATGGGCCT-3’；下游引物為5’-TTGACCACATCCAGGGGTTG-3’，SYBR Green qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置:95℃10min

9、，95℃15S，55℃（ADAMTS9 mRNA為57℃）30S，72℃30S，40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行管,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次;(3)數(shù)據(jù)分析相對(duì)表達(dá)水平用2-??Ct方法計(jì)算，miR-32的表達(dá)選用U6基因?yàn)閮?nèi)參，ADAMTS9 mRNA的表達(dá)選用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。
　　5、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　miR-32過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組及 miR-32-5p inhibitor組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

10、期的細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于6孔板,隨后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%后，采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，miR-32過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組按質(zhì)粒(ug):脂質(zhì)體(ul)=1∶2的比例轉(zhuǎn)染；miR-32-5p inhibitor組使miR-32-5p inhibitor終濃度為150nm進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換為含血清培養(yǎng)基,24h后收集細(xì)胞，提取RNA。
　　

11、6、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞接種于24孔板,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)70%,將細(xì)胞分為6組:共轉(zhuǎn)染 PmiR-ADAMTS9-NC和 mir-NC組、共轉(zhuǎn)染PmiR-ADAMTS9-NC和 miR-32組、共轉(zhuǎn)染 PmiR-ADAMTS9-WT和mir-NC組、共轉(zhuǎn)染 PmiR-ADAMTS9-WT和 miR-32組、共轉(zhuǎn)染PmiR-ADAMTS9-

12、Mut和miR-32-NC組、共轉(zhuǎn)染PmiR-ADAMTS9-Mut和miR-32組，轉(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染24 h后吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，使用1xPBS清洗細(xì)胞2遍，每孔加入100uL稀釋好的1xPLB，搖床常溫條件下進(jìn)行裂解。將白色不透光的96孔酶標(biāo)板置于多功能酶標(biāo)儀內(nèi)，每孔加入之前的細(xì)胞裂解液20uL，做3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每孔分別加入100uL預(yù)先混好的螢火蟲熒光素酶檢測(cè)緩沖液，測(cè)定 Firefly luciferase，檢測(cè)完成后

13、加入100uL海腎熒光素酶檢測(cè)工作液，測(cè)定 Renilla luciferase，用Firefly luciferase除以Renilla luciferase，所得值作為相對(duì)熒光素酶活性。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用單因素方差分析，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)采用t檢驗(yàn)比較組間差異，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)資料采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

14、r>　　1、SMMC-7721, Huh7, HepG人肝癌細(xì)胞株中miR-32的表達(dá)
　　使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的RNA濃度及純度，發(fā)現(xiàn)3株肝癌細(xì)胞總RNA的A260nm／A280nm比值在1．8～2．0之間,說(shuō)明總RNA純度較高，未見明顯降解。
　　qRT-PCR的熔解曲線顯示，miR-32及U6基因分別在80℃與82℃溶解曲線呈單峰,說(shuō)明引物特異性良好, qRT-PCR結(jié)果可信。從擴(kuò)增曲線中可以看出，擴(kuò)增曲線均為

15、S型曲線，各個(gè)樣本的模板質(zhì)量良好，可得到較合適有效的擴(kuò)增。分析結(jié)果顯示:3株肝癌細(xì)胞(SMMC-7721，HepG2，Huh7)中miR-32的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），我們選用SMMC-7721進(jìn)一步研究。
　　2、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721轉(zhuǎn)染后miR-32及ADAMTS9 mRNA表達(dá)情況
　　使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的RNA/質(zhì)粒濃度及純度，溶解曲線及擴(kuò)增曲線分析方法同2.1。
　　SMMC-7

16、721轉(zhuǎn)染后各組間相比較， miR-32表達(dá)豐度分析結(jié)果顯示:miR-32質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中miR-32表達(dá)上調(diào)（P<0.05），轉(zhuǎn)染miR-32-NC質(zhì)粒組則無(wú)明顯差異(P>0.05)；miR-32-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組中miR-32表達(dá)下調(diào)（P<0.05），轉(zhuǎn)染miR-32-5p-NC質(zhì)粒組則無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　SMMC-7721轉(zhuǎn)染后各組間相比較，ADAMTS9 mRNA表達(dá)情況分析結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-3

17、2質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染miR-32-NC質(zhì)粒組ADAMTS9 mRNA相比較表達(dá)下調(diào)（P<0.05），與空白組相比則無(wú)明顯變化(P>0.05)；轉(zhuǎn)染miR-32-5p inhibitor組與轉(zhuǎn)染miR-32-5p inhibitor NC組ADAMTS9 mRNA相比較表達(dá)上調(diào)（P<0.05），與空白組相比較表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　3、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果
　　293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后檢測(cè)熒光素酶活性并將其標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果

18、顯示：在轉(zhuǎn)染PmiR-ADAMTS9-wt組中，轉(zhuǎn)染miR-32同miR-32-NC相比熒光素酶活性降低（ P<0.05）；當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-32時(shí)， PmiR-ADAMTS9-wt組與PmiR-ADAMTS9-mut組相比熒光素酶活性也同樣出現(xiàn)了降低（P<0.05），結(jié)合以上結(jié)果說(shuō)明miR-32可與ADAMTS9 mRNA3'-UTR結(jié)合，抑制熒光素酶活性，當(dāng)未結(jié)合時(shí)，熒光素酶活性回復(fù)升高。
　　結(jié)論：
　　miR-32通