在宮頸癌細(xì)胞中microRNA-429下調(diào)IKKβ的表達(dá)發(fā)揮抑癌基因的作用.pdf

1、目的：宮頸癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中排名第四位，而且在年輕女性中有發(fā)病率增加的趨勢。已有大量研究表明，宮頸癌的發(fā)生與HPV感染相關(guān)，但隨著對宮頸癌研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)microRNAs（miRNAs）也能夠參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中。miRNAs是長度大約為22nt的單鏈非編碼RNA，能夠通過與mRNA3’UTR的結(jié)合來抑制其翻譯或降解其mRNA，達(dá)到調(diào)節(jié)體內(nèi)靶基因表達(dá)的目的，通過上述過程，miRNA參與調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)

2、生相關(guān)的增殖、遷徙、轉(zhuǎn)移和凋亡等多個過程。已有文獻(xiàn)報道，宮頸癌的發(fā)生伴隨著多種miRNAs表達(dá)譜的異常改變，暗示著miRNAs可能與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)。已發(fā)現(xiàn) miR-429在許多腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并具有抑制腫瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，但在宮頸癌中的作用還不清楚。因此本研究旨在探討 miR-429在宮頸癌中細(xì)胞中的作用，及其發(fā)揮作用的分子學(xué)機制，為更好的研究宮頸癌發(fā)生的分子學(xué)機制提供新的基礎(chǔ)。
　　方法：首先我們通過RT-qPCR實驗檢

3、測了15對宮頸癌組織中miR-429的表達(dá)水平，然后通過MTT實驗、集落實驗和凋亡實驗檢測了miR-429對宮頸癌細(xì)胞系HeLa和C33A細(xì)胞增殖和凋亡的影響。接下來我們利用生物信息學(xué)方法，通過miRBase Targets、TargetScan和PicTar等靶基因預(yù)測軟件，篩選出IKKβ作為miR-429的靶基因，隨后我們構(gòu)建了包含IKKβ3’UTR的野生型和突變型序列的EGFP報告載體，然后通過熒光報告載體實驗證實miR-429靶

4、定IKKβ并下調(diào)其表達(dá)，接下來，我們還通過Real-time PCR和western blotting實驗分別從mRNA水平和蛋白水平證實了二者的靶定關(guān)系，另外，還通過RT-qPCR實驗檢測了15對宮頸癌組織中IKKβ的表達(dá)水平，并對宮頸癌組織中miR-429和IKKβ進(jìn)行了相關(guān)性分析。為了深入研究miR-429和IKKβ的關(guān)系和靶基因IKKβ的功能，構(gòu)建了 IKKβ過表達(dá)和敲降質(zhì)粒，并且通過 MTT實驗、集落實驗和凋亡實驗證實IKKβ

5、具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞HeLa和C33A增殖和抑制細(xì)胞凋亡的功能。最后，通過挽救實驗來證實 miR-429對宮頸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的影響是由IKKβ介導(dǎo)實現(xiàn)的。
　　結(jié)果：與癌旁正常組織相比，在宮頸癌組織中 miR-429表達(dá)下調(diào)。過表達(dá)miR-429能夠抑制宮頸癌細(xì)胞 HeLa和 C33A的增殖能力并誘導(dǎo)其凋亡。利用miRBase Targets、TargetScan和PicTar等生物信息學(xué)軟件預(yù)測IKKβ的3’UTR區(qū)域存在

6、miR-429的結(jié)合位點。通過熒光報告載體實驗證實 miR-429直接靶定IKKβ并下調(diào)其表達(dá)，Real-time PCR和western blotting實驗也分別從mRNA水平和蛋白水平證實了二者的靶定關(guān)系。在宮頸癌組織中 IKKβ表達(dá)上調(diào)且與miR-429呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在宮頸癌細(xì)胞HeLa和C33A中，IKKβ發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用。挽救實驗證實IKKβ介導(dǎo)了miR-429對宮頸癌細(xì)胞的增殖能力和凋亡的影響。