WAPAL基因與其靶microRNA在宮頸癌中的研究.pdf

1、目的:
　　 微小RNA(microRNA,miRNA)是近年新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA,長度為19—25個核苷酸的單鏈RNA分子,廣泛存在于從線蟲到人類的真核生物中。miRNA具有高度的保守性；miRNA的表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性；成熟的miRNA與靶標(biāo)mRNA序列通過完全互補(bǔ)配對或不完全互補(bǔ)配對,引起靶標(biāo)mRNA的降解或翻譯抑制,達(dá)到調(diào)控目的基因表達(dá)的作用。miRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用,并在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、

2、和腫瘤發(fā)生等方面起重要作用。
　　 人類wings apart-like(WAPAL)基因是一個新的姐妹染色單體分離調(diào)節(jié)的因子。最近的研究發(fā)現(xiàn)其在維護(hù)正常細(xì)胞生長和癌癥發(fā)生中起著重要的作用,WAPAL基因的表達(dá)與宮頸癌的關(guān)系尤其密切。認(rèn)為該基因是宮頸癌特異性癌基因。miR-15a,miR-26b在許多腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用,而miR-200b在不同腫瘤組織中的表達(dá)存在明顯的差異,且這三個microRNA的表達(dá)與癌癥患者的治療效

3、果和預(yù)后顯著相關(guān)。我們通過生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)miR-15a、miR-26b及miR-200b最有可能是WAPAL基因的靶向作用miRNA。
　　 目前,有關(guān)miRNA對WAPAL基因表達(dá)調(diào)控的深入研究還未見報(bào)道,為了探究miR-15a、miR-26b及miR-200b對WAPAL基因調(diào)控作用,本課題做了一系列研究。首先檢測WAPAL基因在宮頸癌組織中表達(dá)及其與HPV感染的關(guān)系,然后檢測了miR-15a、miR-26b和miR-2

4、00b在宮頸癌組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示miR-15a和miR-26b在宮頸癌中呈下調(diào)表達(dá),miR-200b在宮頸癌中呈顯著上調(diào)表達(dá)；WAPAL基因的表達(dá)與miR-26b的表達(dá)成負(fù)相關(guān),與miR-200b的表達(dá)成正相關(guān),推測miR-26b可能是WAPAL基因的靶向microRNA。因此,構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞,并用RT-PCR方法、Western blot方法和免疫組化方法檢測了WAPAL基因在SiHa細(xì)

5、胞中mRNA及蛋白表達(dá)情況。該研究為探討WAPAL基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及宮頸癌的基因診斷和治療提供了新思路。
　　 方法:
　　 一、病材來源
　　 選取2006年1月至2008年12月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科診斷歸檔的石蠟標(biāo)本176例,用于WAPAL蛋白的免疫組化分析,年齡29～57歲,平均年齡43歲,其中CINⅠ29例,CINⅡ35例,CINⅢ39例,宮頸癌48例,正常宮頸組織25例,所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理

6、證實(shí),所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。
　　 收集2007年9月至2008年12月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科宮頸癌手術(shù)切除的36例新鮮宮頸癌標(biāo)本,因婦科良性疾病切除的36例正常子宮頸標(biāo)本。用于WAPAL基因mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR分析,所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理證實(shí),宮頸癌標(biāo)本的癌細(xì)胞數(shù)均大于80％,其中G1(高分化癌)9例,G2(中分化癌)19例,G3(低分化癌)8例,標(biāo)本分為宮頸癌組和正常宮頸組。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。

7、
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1,采用免疫組化SP法檢測WAPAL蛋白在人宮頸癌組織,宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(CIN)及正常宮頸組織中的表達(dá)情況；使用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測了宮頸癌組織和正常宮頸組織中WAPAL基因的mRNA表達(dá)水平,用基因芯片的方法對不同宮頸病變組織HPV感染類型進(jìn)行分型檢測。
　　 2,應(yīng)用生物信息學(xué)方法對WAPAL基因的靶向miRNA進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果示miR-15a、miR-26b及miR-200b

8、最有可能是WAPAL基因的靶向miRNA,然后應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測miR-15a、miR-26b和miR-200b在宮頸癌組織中的表達(dá)情況。
　　 3,構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體,所得質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。采用RT-PCR方法、Westernblot方法和免疫組化方法檢測WAPAL基因在宮頸癌SiHa細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)情況。<

9、br>　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。免疫組化結(jié)果免疫積分的比較采用單因素方差分析,組間陽性率的比較采用x2檢驗(yàn)；對于實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果的統(tǒng)計(jì),采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),分析正常宮頸組和宮頸癌組之間的表達(dá)差異情況；WAPAL mRNA的表達(dá)與miRNA表達(dá)之間的相關(guān)性檢測,采用Pearson相關(guān)分析。所有檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1,WAPAL基因在宮頸癌中

10、表達(dá)顯著增加,隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變程度的加深,WAPAL基因蛋白陽性表達(dá)率逐漸增高；相對于正常宮頸組織,宮頸癌組織中WAPAL基因mRNA呈顯著高表達(dá),高危型HPV16／18感染的宮頸病變組織中WAPAL基因蛋白的表達(dá)顯著高于低危型HPV6／11感染及HPV陰性者。
　　 2,相對于正常宮頸組織,miR-15a在宮頸癌組織中表達(dá)降低(P>0.05),平均降低2.985倍:miR-26b在宮頸癌組織中表達(dá)明顯降低(P<0.01),平

11、均降低5.618倍；miR-200b在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯升高(P<0.05),平均升高45.71倍;宮頸癌中WAPAL基因mRNA的表達(dá)與miR-26b的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),與miR-200b的表達(dá)成正相關(guān)(P<0.05)。
　　 3,構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測序結(jié)果證明與miR-26b的序列相符,表明成功構(gòu)建質(zhì)粒,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞后用熒光顯微鏡觀察到綠色熒光,證明構(gòu)建質(zhì)粒在SiHa細(xì)胞中成功表達(dá),RT-PCR、W

12、estern blot和免疫組化結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染miR-26b后WAPAL基因mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、WAPAL基因是宮頸癌組織特異性高表達(dá)的基因,并且與HPV感染有密切關(guān)系。
　　 2、miR-26b和miR-200b在宮頸癌組織中異常表達(dá),且與WAPAL的表達(dá)呈顯著相關(guān),提示miR-26b可能在宮頸癌的發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌基因的作用,而miR-200b可能在宮頸癌的