MicroRNA在宮頸癌中表達的實驗研究.pdf

1、研究目的： 一、應用芯片技術(shù)，篩選在正常宮頸和宮頸癌之間，IIPV陽性和HPV陰性宮頸癌之間差異表達的miRNA； 二、預測差異表達的miRNA的靶分子，探討宮頸癌發(fā)生的機制。 材料和方法： 一、選取13例宮頸癌及其配對的正常宮頸組織樣本，手工顯微切割獲得目標細胞，PCR檢測HPV感染情況； 二、Trizol法分離總RNA，PEG法分離組織混合樣品及HPV陽性的Ca Ski細胞和HPV陰性的C-3

2、3A細胞的低分子量RNA，經(jīng) Cy3熒光標記后與含有576條人類miRNA探針的芯片雜交； 三、用SAM軟件，以FC大于2.5篩選在正常宮頸和宮頸癌之間， HPV陽性和HPV陰性宮頸癌組織之間，Ca，Ski和C-33A細胞之間差異表達的miRNA； 四、實時熒光定量PCR驗證miR-496，miR-34b，miR-34c的差異表達； 五、TargetScan軟件預測差異表達的miRNA的靶基因，尋找和宮頸癌發(fā)生相

3、關(guān)的分子。 實驗結(jié)果： 一、從宮頸癌和正常宮頸組織中純化得到腫瘤細胞和正常鱗狀上皮細胞。13例宮頸癌中HPV陽性11例，陰性2例，13例正常宮頸HPV均為陰性。 二、 RNA經(jīng)定量和電泳檢測，質(zhì)量滿足芯片雜交需求。宮頸癌細胞系，宮頸癌和正常宮頸組織miRNA芯片雜交模型建立成功。 三、發(fā)現(xiàn)38個在正常宮頸和宮頸癌之間差異表達明顯的miRNA。33個miRNA在宮頸癌中表達明顯降低，其中8個miRNA可以預

4、測到靶基因，包括65個腫瘤基因；5個miRNA在宮頸癌中表達明顯升高，但沒預測到靶基因。 四、發(fā)現(xiàn)6個在HPV陽性和HPV陰性宮頸癌組織之間差異表達明顯的miRNA，在HPV陽性的宮頸癌中，有5個表達明顯升高，靶基因中39個是腫瘤基因；1個表達明顯降低且沒有預測到靶基因。 五、發(fā)現(xiàn)16個在Ca Ski和C-33A細胞之間差異表達明顯的miRNA，在Ca Ski組中表達都明顯升高。靶基因中101個是腫瘤基因。 miRNA-

5、34b，34c，200b在組織和細胞系中的差異表達一致。 六、實時熒光定量PCR證實miR-496在宮頸癌中的表達明顯低于正常宮頸；miRNA-34b，34c在HPV陰性宮頸癌中的表達明顯低于HPV陽性宮頸癌；與芯片檢測結(jié)果一致。 結(jié)論： 1．手工顯微切割是從宮頸組織標本中純化目標細胞的有效手段。 2．微陣列芯片是一種有效的高通量分析宮頸癌miRNA差異表達的研究手段。 3．使用含有576個人類m

6、iRNA探針的芯片，篩選出38個在正常宮頸和宮頸癌之間差異表達明顯的miRNA。6個在HPV陽性和HPV陰性宮頸癌組織之間差異表達明顯的miRNA。16個在Ca Ski和C-33A細胞之間差異表達明顯的miRNA。 4．實時熒光定量。PCR證實miR-496在宮頸癌中的表達明顯低于正常宮頸；miRNA-34b，34c在HPV陰性宮頸癌中的表達明顯低于HPV陽性宮頸癌。實時熒光定量PCR是檢測單個miRNA表達水平的有效手段。