Bmi-1分子在宮頸癌中表達(dá)的臨床意義及對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景：
　　 宮頸癌(Uterine cervical cancer,UCC)是婦科常見惡性腫瘤之一,全球每年新增病例49.3萬例,死亡病例27.4萬例。雖然由于細(xì)胞學(xué)篩查策略的廣泛應(yīng)用,UCC的發(fā)病率有明顯下降,但其仍未女性第二大高發(fā)惡性腫瘤。近年來隨著UCC發(fā)病明顯趨于年輕化以及宮頸腺癌發(fā)生比例的明顯增加,對(duì)UCC的診治又提出了新的問題。因此,尋找一種科學(xué)、可行的途徑來提高加對(duì)UCC的早期診斷和預(yù)后判斷,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)UCC

2、的早期發(fā)現(xiàn),早期治療,已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。
　　 目前認(rèn)為高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的感染是導(dǎo)致UCC發(fā)生主要的因素,流行病學(xué)資料顯示高危型HPVDNA在UCC中的檢出率達(dá)95％～100％。然而,在感染高危型HPV的婦女中,只有少數(shù)發(fā)展為UCC,提示可能還有其他因素參與腫瘤的發(fā)生。
　　 B細(xì)胞特異性莫洛尼氏白血病毒插入位點(diǎn)1(B cell-specific MLV in

3、tegrationsite-1,Bmi-1)基因是PcG基因家族的重要成員(PcG),于1991年由荷蘭癌癥中心作為一種原癌基因與另一種癌基因c-myc共同導(dǎo)致B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病而發(fā)現(xiàn)的。Bmi-1通過抑制p16Ink4a和p14Arf兩種抑癌蛋白的表達(dá),能夠抑制p53和pRB生長調(diào)節(jié)途徑誘導(dǎo)的凋亡和衰老。并且,Bmi-1能夠激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因(hTERT),從而能夠延長生命復(fù)制周期,使細(xì)胞發(fā)生無限增殖。最近,Bmi-1發(fā)現(xiàn)在

4、血液惡性腫瘤和部分實(shí)體瘤中呈過表達(dá)。由此可見,Bmi-1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。然而目前有關(guān)Bmi-1在UCC中的表達(dá)情況以及Bmi-1在UCC發(fā)生、發(fā)展中的作用研究國內(nèi)外報(bào)道較少。
　　 基于此,本研究目的是對(duì)Bmi-1在UCC組織和外周血中的表達(dá)進(jìn)行檢測,并通過RNAi技術(shù)抑制UCC細(xì)胞系中Bmi-1基因的表達(dá),觀察Bmi-1在UCC組織和外周血中的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響,探討B(tài)mi-1在U

5、CC早期診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值及Bmi-1在UCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中的作用機(jī)制,為尋找UCC診斷及治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　 第一部分：Bmi-1蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系
　　 目的:觀察Bmi-1在宮頸癌(UCC)中的表達(dá)情況,探討B(tài)mi-1與UCC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法:采用Westernblot方法檢測Bmi-1在宮頸正常上皮細(xì)胞(NCEC)和四種UCC

6、細(xì)胞系(Hela,SiHa,CasKi和C33A)中的表達(dá)。利用免疫組織化學(xué)方法檢測152例UCC和30例癌旁正常石蠟包埋組織中的Bmi-1表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:Westernblot分析顯示,Bmi-1在四種人UCC細(xì)胞系(Hela,SiHa,CasKi和C33A)中過表達(dá),而在NCEC中呈弱表達(dá)。在152例UCC石蠟包埋組織切片中,Bmi-1在27例中呈陰性表達(dá)(-),29例中呈弱陽性表達(dá)(+),55例中呈中度表達(dá)(++)

7、和41例中呈強(qiáng)表達(dá)(+++)。Bmi-1在UCC組織中的過表達(dá)率為63.2％(Bmi-1++或+++)。然而,在30例癌旁正常對(duì)照組織中,Bmi-1只發(fā)現(xiàn)陰性或弱陽性表達(dá)。Bmi-1的過表達(dá)率與腫瘤大小(P=0.046)、臨床分期(P=0.021)和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.010)密切相關(guān),而與患者年齡(P=0.645)、間質(zhì)浸潤深度(P=0.428)、組織類型(P=0.367)和細(xì)胞分化程度(P=0.247)無關(guān)。生存曲線分析顯示,B

8、mi-1的過表達(dá)與患者差的整體生存期(OS)明顯相關(guān)(P=0.021)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示,Bmi-1過表達(dá)是OS的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　 結(jié)論:Bmi-1在UCC中過表達(dá),并且與UCC負(fù)面臨床特征和預(yù)后不良相關(guān),提示Bmi-1參與了UCC的發(fā)生、發(fā)展過程,其可以作為惡性表型和預(yù)后不良的一項(xiàng)預(yù)測指標(biāo)。
　　 第二部分：血漿循環(huán)Bmi-1mRNA的檢測及其對(duì)宮頸癌診斷和預(yù)后價(jià)值的評(píng)價(jià)
　　 目的：評(píng)估血漿循環(huán)

9、Bmi-1mRNA對(duì)宮頸癌(UCC)的潛在診斷和預(yù)后價(jià)值。
　　 方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測109例UCC患者、138例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者(CIN)和80例健康對(duì)照者血漿中循環(huán)Bmi-1mRNA水平。采用受試者工作曲線分析循環(huán)Bmi-1mRNA對(duì)UCC的診斷效能。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析Bmi-1mRNA對(duì)UCC的預(yù)后價(jià)值。
　　 結(jié)果：GAPDH和EEF1A1mRNAs在247例(91.8％)宮頸病變患者和

10、80例(94.1%)健康對(duì)照者中檢測到,兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。UCC組血漿循環(huán)Bmi-1mRNA的中位水平明顯高于CIN各組和健康對(duì)照組(P均<0.001)。CIN2組、C1N3組血漿循環(huán)Bmi-1mRNA的中位水平明顯高于CIN1組、CIN2組和健康對(duì)照組(P均<0.05)。UCC組血漿SCC、CA125的中位水平明顯高于CIN3組、CIN2組、CIN1組和健康對(duì)照組(P均<0.01)。血漿循環(huán)Bmi-1mRNA水

11、平與UCC患者臨床分期(P<0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.002)。循環(huán)Bmi-1mRNA診斷UCC的ROC曲線下面積(AUC)為0.881,最佳臨界值為0.057,診斷敏感性為69.7%,特異性為95.9%。SCC-Ag和CA125診斷UCC的敏感性分別為56.0%和33.9%。循環(huán)Bmi-1mRNA對(duì)UCC的診斷效能明顯高于SCC-Ag(0.740,95%CI=0.689～0.787,P=0.035)和CA125(0.689

12、,95%CI=0.636～0.739, P<0.001)單獨(dú)檢測。Kaplan-Meier曲線分析顯示,高水平的循環(huán)Bmi-1mRNA與較低的無病生存期(DFS)(P=0.001)和整體生存期(OS)(P=0.015)明顯相關(guān)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示,循環(huán)Bmi-1mRNA是DFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　 結(jié)論：循環(huán)Bmi-1mRNA水平在UCC血漿中明顯升高,并且與患者負(fù)面臨床病理特征和預(yù)后不良相關(guān)。循環(huán)Bmi-1mR

13、NA可以作為UCC診斷和預(yù)后判斷的一項(xiàng)潛在的無創(chuàng)性指標(biāo)。
　　 第三部分：Bmi-1對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究
　　 目的：通過siRNA干擾宮頸癌(UCC)SiHa細(xì)胞中Bmi-1的表達(dá),分析沉默Bmi-1的表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響,進(jìn)一步分析Bmi-1在UCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 方法：根據(jù)Bmi-1基因序列,設(shè)計(jì)合成干擾Bmi-1的四條siRNA序列(siRNA-1、 s

14、iRNA-2、siRNA-3和siRNA-4),分別轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA, NC組)、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(加入與實(shí)驗(yàn)組等量的轉(zhuǎn)染試劑,Mock組)和空白對(duì)照組(對(duì)細(xì)胞不做任何處理,Blank組)。RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞中Bmi-1mRNA的表達(dá),應(yīng)用CCK8實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲能力的變化。
　

15、　 結(jié)果：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4組轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞24h、48h后Bmi-1mRNA水平較NC組、Mock組和Blank組明顯降低(P<0.05),其中siRNA-4組的Bmi-1mRNA下降最為明顯。與NC組、Mock組、Blank組比較,siRNA-4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在24、48、72h、96h4個(gè)時(shí)段里生長速度明顯減緩,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48h后,si

16、RNA-4組的凋亡率為(62.43±9.86)%,明顯高于NC組的(10.17±5.15)%、Mock組的(8.56±4.27)%和Blank組的(8.12±3.89)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。侵襲試驗(yàn)中,siRNA-4組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(253.29±68.72)明顯少于NC組(350.21±98.62)、Mock組(406.38±113.51)和Blank組(418.46±119.78)。
　　 結(jié)論：siRNA