鑭化合物對(duì)宮頸癌凋亡相關(guān)microRNA的調(diào)控.pdf

1、目的:
　　分析鑭化合物對(duì)宮頸癌凋亡相關(guān)microRNA的調(diào)控作用，探索鑭抑制宮頸癌增殖、誘導(dǎo)其凋亡的分子機(jī)制，為治療宮頸癌提供新靶點(diǎn)和新思路。
　　方法:
　　1、體內(nèi)研究氯化鑭對(duì)宮頸癌組織中凋亡相關(guān)microRNA表達(dá)的調(diào)控作用:
　　建立小鼠宮頸癌皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為生理鹽水組和氯化鑭組(2mg/kg)，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測小鼠皮下移植瘤和正常小鼠肌肉組織中凋亡相關(guān)miRNA let-7a和miR-

2、34a的表達(dá)。
　　2、體外研究氯化鑭對(duì)人宮頸癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)microRNA表達(dá)的調(diào)控作用:
　　(1)細(xì)胞培養(yǎng)與分組:HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10％ FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于5％CO2、37℃恒溫密閉孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)生長期隨機(jī)分組，即實(shí)驗(yàn)組（培養(yǎng)基中含有5、50、100μM的氯化鑭）和對(duì)照組（培養(yǎng)基中不含氯化鑭），根據(jù)指標(biāo)檢測需要于不同時(shí)間點(diǎn)取樣待測。
　　(2)指標(biāo)檢測:
　?、儆^察氯化鑭對(duì)

3、人宮頸癌細(xì)胞的生長抑制作用:采用MTT比色法檢測兩組細(xì)胞的增殖情況;采用流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞周期阻滯情況。
　?、谟^察氯化鑭對(duì)人宮頸癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)microRNA表達(dá)的影響:采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測兩組細(xì)胞中凋亡相關(guān)miRNA let-7a和miR-34a的表達(dá)。
　　③觀察氯化鑭作用人宮頸癌細(xì)胞后凋亡相關(guān)miRNA let-7a和miR-34a的下游基因表達(dá)的變化:采用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞中Ca

4、spase-3活性;Western blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞中CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、氯化鑭對(duì)小鼠皮下移植瘤組織中凋亡相關(guān)miRNA let-7a和miR-34a表達(dá)的影響:氯化鑭組（2mg/kg）let-7a的相對(duì)表達(dá)量為2.97±0.77，顯著高于生理鹽水組（0.09±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);氯化鑭組(2mg/kg) miR-34a的相對(duì)表達(dá)量為3.15±1.17，

5、亦顯著高于生理鹽水組(0.01±0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;而let-7a和miR-34a在生理鹽水組中的表達(dá)量明顯低于在正常小鼠肌肉組織中的表達(dá)量，且均差異顯著，P＜0.05。由此說明，氯化鑭能明顯上調(diào)宮頸癌組織中l(wèi)et-7a和miR-34a的表達(dá)。
　　2、氯化鑭對(duì)人宮頸癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)microRNA表達(dá)的調(diào)控作用:
　　(1)氯化鑭對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的抑制作用:不同濃度的氯化鑭(5，50，

6、100μM)對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制率分別為24％，51％，78％，均顯著高于對(duì)照組（0，P＜0.05），抑制效應(yīng)呈劑量依賴關(guān)系。
　　(2)氯化鑭對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的周期阻滯作用:隨著氯化鑭濃度提高，G1期細(xì)胞明顯增多，5、50、100μM濃度組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);S期細(xì)胞明顯減少，5、50、100μM濃度組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01); G2期細(xì)胞也明顯減少，5、5

7、0、100μM濃度組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果說明氯化鑭能導(dǎo)致大多HeLa細(xì)胞阻滯于G1期，并呈一定的濃度依賴性。
　　(3)氯化鑭作用HeLa細(xì)胞后凋亡相關(guān)miRNA let-7a和miR-34a表達(dá)的變化:5μM和50μM的氯化鑭作用人宮頸癌HeLa細(xì)胞后，let-7a的表達(dá)無明顯變化，與對(duì)照組相比差異均不顯著（P＞0.05）;而100μM氯化鑭則可顯著上調(diào)let-7a的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義(P＜0.01)。低濃度氯化鑭(5μM)對(duì)miR-34a表達(dá)的影響不顯著;但50μM和100μM氯化鑭則可顯著上調(diào)人宮頸癌HeLa細(xì)胞miR-34a的表達(dá)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　(4)氯化鑭作用人宮頸癌細(xì)胞后凋亡相關(guān)miRNA let-7a和miR-34a的下游基因表達(dá)的變化:
　?、貱aspase-3活性分析:低濃度氯化鑭(5μM)即可有效誘導(dǎo)活化型Caspase-3表達(dá)，且隨著氯化鑭濃度的

9、升高，誘導(dǎo)作用呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)。
　?、赪estern blot技術(shù)檢測CyclinD1和Bcl-2表達(dá)的變化:隨氯化鑭濃度的增加(5、50、100μM)，CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，并呈一定的劑量依賴效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　氯化鑭可能通過上調(diào)凋亡相關(guān)miRNA let-7a和miR-34a的表達(dá)，影響周期特異性蛋白CyclinD1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)，從而發(fā)