瓦草三萜皂甙類(lèi)化合物對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及作用機(jī)制的研究.pdf

1、前言:
　　 目前惡性腫瘤已成為危害人類(lèi)生命健康最重要的疾病之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示,全世界每年約1300萬(wàn)癌癥新增患者,死亡約760萬(wàn),已成為威脅人類(lèi)生命健康的第二大殺手,因此尋找有效的癌癥治療手段已成為必然。
　　 在惡性腫瘤的治療中,化學(xué)治療占重要地位,包括使用天然的或化學(xué)合成制劑來(lái)抑制腫瘤,而在化學(xué)合成的抗腫瘤藥物中絕大多數(shù)是以天然植物為先導(dǎo)化合物的藥物。因此,從天然植物成分中篩選抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物,已成

2、為目前尋找抗腫瘤藥物的一個(gè)理想途徑。
　　 云南民間中草藥瓦草為石竹科繩子草屬植物黏萼繩子草SileneviscidulaFranch.的干燥根,具有清熱、利濕、通淋的功效,民間主要用于治療肺熱咳嗽、濕熱淋病、風(fēng)濕骨痛、頭痛、牙痛、脘腹疼痛、跌打傷痛、產(chǎn)后宮縮痛等癥,但目前尚未見(jiàn)瓦草的化學(xué)成分及抗腫瘤藥理作用的相關(guān)報(bào)道。
　　 本研究對(duì)沈陽(yáng)藥科大學(xué)從瓦草乙醇提取物中首次分離鑒定的16個(gè)三萜皂甙類(lèi)化合物和2個(gè)蛻皮甾酮類(lèi)化合

3、物的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步篩查,發(fā)現(xiàn)其中3種成分具有不同程度的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,經(jīng)藥物結(jié)構(gòu)分析證實(shí),這三種化合物在結(jié)構(gòu)上均為三萜皂甙類(lèi)化合物,已有研究表明,三萜皂甙類(lèi)化合物,具有化學(xué)預(yù)防、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等作用。為進(jìn)一步探討瓦草三萜皂甙類(lèi)化合物的抗腫瘤機(jī)制,本研究選取對(duì)8/9化合物最為敏感的HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象,觀(guān)察其對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,并從抑制細(xì)胞增殖方面進(jìn)一步探討瓦草三萜皂甙

4、類(lèi)化合物誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期的作用機(jī)理。
　　 方法:
　　 一、瓦草三萜皂甙類(lèi)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　 1.MTT法檢測(cè)瓦草18種提取物對(duì)人大腸癌HT-29細(xì)胞系的抗腫瘤活性
　　 2.MTT法檢測(cè)8/9化合物對(duì)不同細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用
　　 3.CCK-8法檢測(cè)8/9、10/11、12/13三種化合物對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　 4.CCK-8法檢測(cè)8/9化合物對(duì)

5、HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的時(shí)間與劑量關(guān)系
　　 二、8/9化合物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用
　　 1.8/9化合物作用HeLa細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)觀(guān)察
　　 2.凝膠電泳檢測(cè)8/9化合物作用HeLa細(xì)胞后的DNA片段改變
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)8/9化合物作用HeLa細(xì)胞后誘導(dǎo)凋亡的作用
　　 三、8/9化合物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞周期阻滯作用及機(jī)制
　　 1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)8/9化合物作用HeLa

6、細(xì)胞后細(xì)胞周期阻滯作用
　　 2、WesternBlot及RT-PCR方法檢測(cè)8/9化合物對(duì)HeLa細(xì)胞G1期關(guān)鍵蛋白cyclinD1在蛋白及mRNA水平上的影響
　　 3、WesternBlot方法及免疫共沉淀方法檢測(cè)8/9化合物對(duì)HeLa細(xì)胞G1期相關(guān)蛋白水平的影響
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、瓦草三萜皂甙類(lèi)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　 1.通過(guò)MTT法篩查瓦草18種提取物對(duì)人大腸癌H

7、T-29細(xì)胞系的抗腫瘤活性,結(jié)果顯示有多種化合物具有抗腫瘤活性,其中8/9、10/11、12/13三種化合物較其他化合物作用明顯。
　　 2.為進(jìn)一步探討瓦草三萜皂甙類(lèi)化合物的抗腫瘤作用,我們選取了8/9化合物進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。通過(guò)MTT法篩查8/9化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用,結(jié)果顯示8/9化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系均有生長(zhǎng)抑制作用,本研究選取其中對(duì)8/9化合物最為敏感的人宮頸癌HeLa細(xì)胞作為研究對(duì)象。
　　 3.通

8、過(guò)CCK-8法檢測(cè)8/9、10/11、12/13三種化合物對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,結(jié)果顯示8/9、10/11、12/13三種化合物對(duì)HeLa細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用,三者活性強(qiáng)弱依次為8/9＞10/11＞12/13。
　　 4.CCK-8法檢測(cè)8/9化合物對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用有明顯的劑量依賴(lài)性,且在藥物作用12h即產(chǎn)生明顯的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 二、8/9化合物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用
　　 1.不同

9、濃度8/9化合物作用HeLa細(xì)胞24h后,相差顯微鏡下對(duì)其形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀(guān)察可見(jiàn):細(xì)胞變圓、體積變小、貼壁性減弱;DAPI染色后熒光顯微鏡下對(duì)其形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀(guān)察未見(jiàn)核固縮、核碎裂、核溶解等典型的凋亡小體形態(tài)。
　　 2.凝膠電泳檢測(cè)其DNA變化結(jié)果顯示并未出現(xiàn)凋亡特有的DNALadder條帶。
　　 3.AnnexinV-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:隨著8/9化合物濃度的增加,發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞未見(jiàn)增多。

10、>　　 通過(guò)以上不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,8/9化合物抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。
　　 三、8/9化合物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞周期阻滯作用及機(jī)制
　　 1、PI單染后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞阻滯在G1期。
　　 2、8/9化合物對(duì)G1期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響:結(jié)果顯示,隨著8/9化合物作用濃度的增加,G1期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子cyclinD1在蛋白水平上表達(dá)下降,而在mRNA水平上未見(jiàn)改變

11、。
　　 3、8/9化合物能夠影響G1期相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化:免疫共沉淀方法檢測(cè)8/9化合物對(duì)HeLa細(xì)胞G1期相關(guān)因子E2F1蛋白表達(dá)量的影響。
　　 結(jié)論:
　　 1.明確瓦草中雙糖鏈三萜皂甙類(lèi)化合物具有廣譜抗腫瘤活性。
　　 2.三萜皂甙類(lèi)化合物可通過(guò)上調(diào)P16蛋白及下調(diào)cyclinD1蛋白表達(dá),使Rb磷酸化水平降低,轉(zhuǎn)錄因子E2F1活性缺乏,HeLa細(xì)胞阻滯于G1期,從而抑