檸檬苦素類化合物抑制人肺腫瘤細胞增殖活性及作用機制.pdf

1、檸檬苦素類化合物是一系列含呋喃環(huán)的高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，主要存在于蕓香科（Rutaceae）和楝科（Meliaceae）植物中，其味苦，具有抗腫瘤、抗病毒、廣譜抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、抗瘧原蟲等生物藥物活性。楝科植物木果楝(Xylocarpusgranatum)為一種生長在熱帶沿海地帶的紅樹林植物，海南民間用其種皮治療赤痢，種仁用作滋補品，在東南亞國家民間用其治療腹瀉、霍亂和由瘧疾引起的發(fā)熱，還可用作昆蟲拒食劑。本研究首次檢測

2、了從木果楝種子中純化的八種檸檬苦素類化合物抑制人肺腫瘤細胞增殖的效應(yīng)，并進一步選取與細胞凋亡相關(guān)的蛋白p53和Bax為研究對象，探討了檸檬苦素類化合物抑制腫瘤細胞增殖的作用機制。為開發(fā)新的抗腫瘤細胞增殖活性強，并且毒副作用低的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分八種檸檬苦素類化合物對人肺腫瘤細胞增殖活性的抑制作用
　　目的：觀察8種檸檬苦素類化合物XylocarpinH(1)、XylogranatinC(2)、Xylomexi

3、caninA(3)、xylogranatinD(4)、7-Deacetyl-7-oxogedunin(5)、XyloccensinK(6)、xylocarponoidA(7)和Odoratone(8)對人肺腫瘤細胞增殖的抑制作用，以篩選出具有明顯抑制腫瘤細胞增殖活性的化合物。
　　方法：采用4-甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞增殖。將人肺腫瘤細胞接種于96孔板，每孔含1×104個細胞，分別加入溶劑對照（終濃度為0.1％DMSO）、

4、陽性對照順鉑和終濃度分別為100μmol/L或以100μmol/L為起始濃度，倍比稀釋8個濃度梯度的八種檸檬苦素類化合物，每組設(shè)3復孔，置于飽和濕度、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，加入5mg/mLMTT。實驗終止測定各孔吸光度值（OD值），用Origin7.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)?標準差（x?s）表示，實驗用化合物對腫瘤細胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學模型擬合，計算藥物的IC50值。
　　結(jié)果：

5、（1）100μmol/L順鉑處理三種人非小細胞肺癌細胞：A549、RERF-LC-kj和QG-56后，顯示較強的抑制人非小細胞肺癌細胞增殖的活性，細胞生存率分別為28.98%、44.66%和39.54%；用終濃度為100μmol/L的八種檸檬苦素類化合物1~8處理三種實驗用人非小細胞肺癌細胞后，化合物2、4、5、7、8顯示與順鉑相同或強于順鉑的抑制A549、RERF-LC-kj和QG-56細胞系增殖的作用；（2）100μmol/L順鉑和

6、八種檸檬苦素類化合物1~8處理人小細胞肺癌細胞（QG-90和PC-6細胞）后，化合物2、4、5、7、8顯示強于順鉑的抑制QG-90和PC-6細胞增殖活性；（3）通過腫瘤細胞增殖生存率對XylogranatinC(2)濃度的對數(shù)回歸方程，得到XylogranatinC(2)對A549、RERF-LC-kj、QG-56、QG-90和PC-6細胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為4.79μmol/L，12.07μmol/L，23.22μmo

7、l/L，4.40μmol/L和4.57μmol/L。
　　結(jié)論：XylogranatinC可明顯抑制人肺腫瘤細胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性，對于9,10-開裂的墨西哥交酯型且C-30位上羥基氫的取代基較小的檸檬苦素顯示較強的抑制肺腫瘤活性。
　　第二部分檸檬苦素類化合物XylogranatinC對人肺腫瘤細胞凋亡的影響及其機制研究
　　目的：以往大量實驗已證明，許多抗癌藥物均可誘導不同類型的腫瘤細胞凋亡，多種中草藥提取的單

8、體化合物是通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。第一部分實驗證實了檸檬苦素類化合物對人肺腫瘤細胞增殖有明顯的抑制作用。本部分實驗將利用流式細胞術(shù)（FCM）檢測檸檬苦素類化合物XylogranatinC是否能誘導人肺腫瘤細胞凋亡，Westernblot觀察凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax和caspase-3的表達變化，以探討檸檬苦素類化合物XylogranatinC的抗腫瘤作用機制。
　　方法：（1）流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：終濃度為10μmo

9、l/L的檸檬苦素類化合物XylogranatinC孵育細胞24h，收集細胞。用PBS洗滌3次，胰蛋白酶消化，用70%的乙醇固定；加入10%雞紅細胞作為內(nèi)參標準，與樣品同步染色，加入碘化丙啶一步插入DNA熒光染色（PropidiumIodide,PI:50mg/L，triton-x1001.0%），在4℃冰箱避光染色30min，以500目銅網(wǎng)過濾，使樣品成為合格的單細胞懸液，并調(diào)節(jié)細胞濃度為5×105~5×106/L。采用美國Beckma

10、nCoulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行DNA檢測。（2）Westernblot檢測p53、Bax及Caspase-3的變化：取對數(shù)生長期細胞，按2×106個細胞/培養(yǎng)皿接種A549細胞。加入終濃度為10?mol/L的陽性對照順鉑和XylogranatinC的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48h，離心收集細胞，用PBS洗滌細胞后，加入上樣緩沖液100?L，劇烈震蕩后冰浴下超聲波處理1min。100℃加熱3min使蛋白質(zhì)變性，1500

11、0r/min離心15min，取上清液測定蛋白濃度。取50?g蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，分離膠為12%，濃縮膠為5%。根據(jù)預染的蛋白Marker指示，小心割取GR所在的區(qū)帶，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉于室溫下?lián)u動封閉膜1h。膜在抗Caspase-3多克隆抗體(1:800)、抗Bax多克隆抗體(1:1000)、抗p53多克隆抗體（1:1000）和β-actin(1:1000)稀釋液中室溫過夜，1×TBS-T洗膜15min，共

12、3次后，在二抗稀釋液(抗鼠1:20000)中避光孵育20min。再次洗膜后加入ECL試劑，反應(yīng)5min，用X片曝光1~10min后，顯影?；瘜W發(fā)光法顯色。用Imagej圖像分析軟件對其進行半定量分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），用最小顯著差法（leastsignificantdifference,LSD）作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：（1）Xylograna

13、tinC對A549細胞凋亡的影響：10μmol/L的XylogranatinC處理A549細胞24h后，A549細胞早期凋亡率為(31.7±2.6)%，與空白對照組(5.4±0.4)%比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示XylogranatinC促進了A549細胞的凋亡。（2）XylogranatinC對A549細胞內(nèi)p53蛋白、Bax蛋白和caspase-3蛋白的上調(diào)作用：10μmol/L的順鉑和XylogranatinC作

14、用A549細胞后，均可明顯上調(diào)細胞內(nèi)的p53、Bax和caspase-3表達。（3）半胱天冬酶抑制劑對XylogranatinC抑制A549細胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用：使用1、10和100μmol/L的順鉑和XylogranatinC處理A549細胞，其細胞生存率分別為83.66%、56.27%、28.98%和59.87%、24.31%、2.76%；使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與順鉑和XylogranatinC共同孵育A549細胞后，

15、其細胞生存率分別上升為97.77%、74.90%、56.34%和82.78%、46.27%、10.98%。
　　結(jié)論：檸檬苦素類化合物XylogranatinC可明顯誘導人肺腫瘤細胞A549細胞凋亡；XylogranatinC可上調(diào)A549細胞p53表達，上調(diào)Bax表達,上調(diào)caspase-3蛋白表達，這可能是檸檬苦素類化合物XylogranatinC引起A549細胞凋亡的機制之一。而且實驗也證明了半胱天冬酶抑制劑能夠翻轉(zhuǎn)由Xyl