東北紅豆杉(Taxus cuspidata)中紫杉烷類化合物抗腫瘤細(xì)胞增殖活性及其作用機制的初步研究.pdf

1、紫杉醇是美國北卡羅萊納州三角研究所的Wall博士和Wani博士于1967年發(fā)現(xiàn)的。之后，他們又從太平洋紅豆杉中分離出了這種化合物并發(fā)現(xiàn)它具有廣泛的抗惡性腫瘤作用。紫杉醇是至今所知的最好的治療卵巢癌和乳腺癌的藥物，價格非常昂貴，市場售價為4800美元/克。并且它的自然資源-紅豆杉和東非羅漢松（1999年測知含紫杉醇）均生長十分緩慢，數(shù)量有限且其中有效成分的含量非常低。東北紅豆杉（Taxus cuspidata）是常綠喬木，散生于海拔500

2、至1000米的密林中，適合冷且潮濕的酸性土壤，分布于朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、日本和我國的黑龍江東南部、吉林東部及遼寧。
　　 目的：隨著近年來對紫杉醇及其前體物的需求量不斷攀升，尋找新的生物資源保護生態(tài)環(huán)境已迫在眉睫。研究者們近年來通過提取分離得到了大量的紫杉醇類似物，但迄今為止仍沒有紫杉醇的第二代藥物上市。目前紫杉烷類成分只有紫杉醇和以巴卡亭Ⅲ或10-去乙?；涂ㄍあ鬄榍绑w的半合成藥物紫杉特爾（Taxotere）應(yīng)用于臨床。因此

3、對新紫杉烷類藥物的研究主要是尋找具有較低毒副作用、較高抗腫瘤選擇性及對多種腫瘤細(xì)胞尤其是對有抗藥性的人體腫瘤細(xì)胞有較高生物活性的紫杉烷類化合物。本研究的目的就是將從東北紅豆杉中分離及純化得到的紫杉烷類化合物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的篩選，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用MTT比色法對所選取的東北紅豆杉中的紫衫烷類化合物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞增殖的活性篩選。首先考察具有不同母核結(jié)構(gòu)的紫衫烷類化合物對宮

4、頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響；然后考察具有相同母核結(jié)構(gòu)、不同連接側(cè)鏈的紫衫烷類化合物對HeLa細(xì)胞增殖的影響；最后選擇母核結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈都相同的紫衫烷類化合物，考察母核上的不同取代基對紫衫烷類化合物抗HeLa細(xì)胞增殖的影響。
　　 2.選擇具有活性母核結(jié)構(gòu)、活性側(cè)鏈和取代基的紫杉烷類化合物，考察它們對五種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 3.機制研究：采用細(xì)胞增殖抑制試驗，以Taxol作為陽性對照，觀察HeLa細(xì)胞在經(jīng)篩選出的活

5、性化合物Compound22作用48、96和144h后，分別計數(shù)細(xì)胞濃度，繪制細(xì)胞增殖曲線以進(jìn)行比較。流式細(xì)胞儀及Annexin V-FITC試劑盒分析細(xì)胞凋亡情況。WesternBlot方法檢測經(jīng)化合物20α，10β-Diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ處理的HeLa細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase3和Caspase9的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.6/10/6母核結(jié)構(gòu)的化合物

6、7-Deacetyl-taxine E（17）即使用100μmol/L的濃度處理HeLa細(xì)胞，其生存率為97％，對HeLa細(xì)胞的增殖不顯示任何抑制活性；6/8/6母核結(jié)構(gòu)的化合物Decinnamoytaxinine E（12）、6/5/5/6母核結(jié)構(gòu)的化合物Taxinine L（23）和6/12母核結(jié)構(gòu)的化合物Taxachitriene A（24）三種化合物用100μmol/L的濃度處理HeLa細(xì)胞，對其增殖顯示較弱的抑制活性，生存率分

7、別為74％、73％和71％，與空白對照相比均有顯著性差異（P<0.05）。
　　 2.16/8/6母核結(jié)構(gòu)的5位碳原子上連接具有水溶性的糖側(cè)鏈的紫杉烷類化合物（10），用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L處理HeLa細(xì)胞，其生存率分別為98％、86％和79％；在6/8/6母核結(jié)構(gòu)的5位碳原子上連接具有脂溶性的Cinnamoyl側(cè)鏈的紫杉烷類化合物（9）和連接具有堿性的Winterstein側(cè)鏈的紫杉烷類化合物（

8、2），用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L處理HeLa細(xì)胞，其生存率分別為84％、46％、21％和89％、86％、34％，對HeLa細(xì)胞增殖顯示較強的抑制活性，均呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系。
　　 2.2只具有6/12母核結(jié)構(gòu)，沒有連接任何側(cè)鏈的化合物（24）用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L處理HeLa細(xì)胞，其生存率分別為100％、97％和71％，對HeLa細(xì)胞的增殖顯示較弱的抑制活性，當(dāng)在5

9、位碳原子上引入脂溶性的Cinnamoyl側(cè)鏈的化合物（25），用與化合物（24）相同的濃度處理HeLa細(xì)胞，其生存率分別為100％、100％和65％，未顯示一個明顯的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的提高。
　　 2.3只具有6/5/5/6母核結(jié)構(gòu)，沒有連接任何側(cè)鏈的化合物23用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L處理HeLa細(xì)胞，其生存率分別為100％、93％和73％，對HeLa細(xì)胞的增殖顯示較弱的抑制活性，當(dāng)在5位碳原子上

10、引入脂溶性的Cinnamoyl側(cè)鏈的化合物（22），用與化合物23相同的濃度處理HeLa細(xì)胞，其生存率分別為100％、64％和32％，10μmol/L和100μmol/L組與空白對照組相比具有顯著性（P<0.05）和非常顯著性的差異（P<0.01），明顯地提高了這類紫杉烷化合物的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。
　　 2.4只具有6/10/6母核結(jié)構(gòu)，沒有連接任何側(cè)鏈的化合物（17）用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L處理

11、HeLa細(xì)胞，其生存率分別為100％、100％和97％，對HeLa細(xì)胞的增殖不顯示任何抑制活性；當(dāng)在5位碳原子上引入脂溶性的Cinnamoyl側(cè)鏈的化合物（18）和具有堿性的Winterstein側(cè)鏈的化合物（19），用與化合物（17）相同的濃度處理HeLa細(xì)胞，其生存率分別為100％、100％、95％和98％、97％、73％，均未顯示一個明顯的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的提高。
　　 3.當(dāng)母核上的取代基均為乙?；幕衔铮?），用1

12、00μmol/L處理HeLa細(xì)胞，其生存率下降為66％；當(dāng)母核上有一個羥基取代基的紫杉烷類化合物（8）用100μmol/L處理HeLa細(xì)胞，其生存率下降為51％；當(dāng)母核上有兩個羥基取代基的紫杉烷類化合物（9）用相同濃度處理HeLa細(xì)胞，其生存率繼續(xù)下降為21％。
　　 4.化合物（7）對HEC-1細(xì)胞、T-98細(xì)胞和HMV-1細(xì)胞的增殖具有抑制活性，IC50分別為32μmol/L、37μmol/L和23μmol/L，化合物（9）

13、僅對HEC-1細(xì)胞的增殖具有抑制活性，IC50為33μmol/L，化合物（22）對HEC-1細(xì)胞、HOC-21細(xì)胞、T-98細(xì)胞和HMV-1細(xì)胞的增殖均具有抑制活性，IC50分別為58μmol/L、15μmol/L、11μmol/L和36μmol/L。
　　 5.HeLa細(xì)胞增殖實驗的結(jié)果表明：紫杉烷類化合物2α，10β-Diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ（22）干擾腫瘤細(xì)胞增殖的作用趨勢與紫杉

14、醇極其相似（圖20），因此推測其發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖作用可能與干擾細(xì)胞周期有關(guān)。
　　 6.經(jīng)凋亡實驗研究證實，化合物（22）可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。它通過引起腫瘤細(xì)胞的凋亡從而減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，通過激活caspase通路引起Hela細(xì)胞的凋亡（圖23），而且Bcl-2家族蛋白也參與了此凋亡反應(yīng)，增加了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，以及抑制抑凋亡蛋白Bcl-2，從而實現(xiàn)其誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡（圖22）。
　　 結(jié)論：

15、　　 1.具有6/8/6三環(huán)和6/5/5/6四環(huán)母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。
　　 2.Cinnamoyl側(cè)鏈和Winterstein酰基側(cè)鏈的存在，均能增加6/8/6三環(huán)和6/5/5/6四環(huán)母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。
　　 3.母核上的取代基為羥基的化合物的活性要高于取代基為乙?；幕衔?，且其活性與羥基的數(shù)量成正比。
　　 4.紫杉烷類化合物（22）通過激活caspas