紅豆杉中紫杉烷類化合物抗人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖活性及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分、紅豆杉中新紫杉烷類二萜類化合物體外抗人子宮內(nèi)膜癌活性篩選子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤，盡管子宮內(nèi)膜癌的早期診斷及治療方法取得了很大進(jìn)展，但其年發(fā)病率及死亡率仍在不斷升高。藥物治療已成為復(fù)發(fā)性內(nèi)膜癌的主要治療方式。植物源性藥物在多種疾病尤其是癌癥的治療中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，從太平洋紅豆杉（Taxus brevifolia）樹皮中分離得到的紫杉醇(Taxol)是臨床上最為重要的抗癌制劑。由于紫杉醇是從太平洋紅豆杉的樹皮中分離得

2、到的，而太平洋紅豆杉生長(zhǎng)速度慢，樹皮中紫杉醇含量低，一旦剝離樹皮樹木也難以生存，大大限制了紫杉醇的開發(fā)利用。因此亟待尋找具有較低毒副作用、較高抗腫瘤選擇性及對(duì)多種腫瘤細(xì)胞尤其是對(duì)有抗藥性的人體腫瘤細(xì)胞有較高生物活性的紫杉烷類化合物。
　　 目的:為尋找活性強(qiáng)、毒副作用小的化合物，本研究對(duì)紅豆杉可再生針葉中提取純化得到的48種非紫杉醇二萜類化合物為對(duì)象，對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖抑制活性進(jìn)行了篩選，這對(duì)于擴(kuò)大植物藥源，尋找和開發(fā)新的抗

3、癌先導(dǎo)化合物或藥物都具有重要意義。
　　 方法:應(yīng)用MTT比色法進(jìn)行活性篩選。細(xì)胞接種于96孔板，每孔含1×104個(gè)細(xì)胞，分別加入溶劑對(duì)照（終濃度0.1％ DMSO）、陽性對(duì)照紫杉醇和終濃度為100μmol/L各種實(shí)驗(yàn)用化合物，每組設(shè)3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入5 mg/mL MTT。實(shí)驗(yàn)終止測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，測(cè)定波長(zhǎng)入=570 nm，參考波長(zhǎng)入=630

4、 nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(％)=（給藥組OD值/對(duì)照組OD值）×100;計(jì)算實(shí)驗(yàn)用化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。
　　 結(jié)果:48種紫杉烷類化合物抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1的增殖活性的篩選結(jié)果為:18種紫杉烷類化合物對(duì)HEC-1細(xì)胞增殖的抑制活性極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。當(dāng)用100μmol/L10-deacetyl-13-oxobaccatinⅢ(1),13-oxobaccatinⅢ(2), bac

5、catinⅢ(3),9-dihydro-13-acetyl-baccatinⅢ(4)處理HEC-1細(xì)胞48 h后腫瘤細(xì)胞的存活率分別為48.94％、40.17％、22.51％和28.34％;100μmol/L7-epi-10-deacetyltaxol(5),7,13-dideacetyl-9,10-didebenzoyl-taxchinin C(6),10β-hydroxy-2α,9α,13α-triacetoxy-5α-cinnam

6、atetaxa-4(20),11-diene(10)和7β,9α-dideacetyl-5-decinnamoyl-taxinine J(11)處理HEC-1細(xì)胞48 h后腫瘤細(xì)胞的存活率分別為6.00％、72.85％、10.52％和19.97％;當(dāng)用100μmol/L11-diene(12)、10-deacetyltaxinine(17)、9,10-deacetyltaxinine(19)和taxagifin(25)處理HEC-1細(xì)胞

7、時(shí)，細(xì)胞存活率分別為12.91％、33.80％、8.78％和25.33％;當(dāng)用100μmol/L taxezopidine J(27)、2α,10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)、2,9-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(30)和taxachitriene A(32)處理HEC-1時(shí)，細(xì)胞存活率分別為:19.85％、7.64％、4.61％和67.00％;

8、當(dāng)用100μmol/L5α-cinnamoyloxytaxin B(37)和5α，10β,13α-triacetoxytax-11-ene-2α，7β，9α，20-tetraol(44)作用HEC-1細(xì)胞時(shí)，存活率分別為42.15％和49.37％。其中，化合物(5)、(10)、(19)、(29)和(30)對(duì)HEC-1細(xì)胞增殖的抑制活性高于紫杉醇，五種化合物對(duì)HEC-1細(xì)胞的IC50值分別為0.15μmol/L、3.75μmol/L、4.

9、91μmol/L、1.08μmol/L和3.96μmol/L，化合物(5)和(29)的IC50值低于紫杉醇。
　　 結(jié)論:從紅豆杉科植物的針葉中提取的化合物(5)、(10)、(19)、(29)和(30)五種非紫杉醇二萜類化合物對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制活性。
　　 第二部分、新紫杉烷類化合物構(gòu)-效關(guān)系研究紫杉烷類化合物是從植物中得到的一大類天然產(chǎn)物，在結(jié)構(gòu)分類上屬于二萜類，故又稱之為紫杉烷二萜。紫杉醇(Taxo

10、l)是從紅豆杉屬（Taxus）植物中分離得到的紫杉烷二萜成分，其顯著的抗腫瘤活性和獨(dú)特的作用機(jī)理令世人囑目。盡管紫杉醇的臨床應(yīng)用廣泛且取得了巨大成功，但仍存在藥物溶解性低、毒副作用大、耐藥現(xiàn)象等諸多問題，因此對(duì)其構(gòu)效關(guān)系及結(jié)構(gòu)改造的探討已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，以期找到天然結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單、活性更強(qiáng)的類似物或替代分子。
　　 目的:為系統(tǒng)分析紫杉烷類化合物抗腫瘤活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，將從紅豆杉分離提取的48種紫杉烷類化合物依據(jù)其母核及

11、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分組，研究了其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及其他婦科腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的影響，以期為紫杉烷類化合物的開發(fā)和利用提供合成實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。
　　 方法:將48種紫杉烷類化合物按結(jié)構(gòu)分為四組:1、具有4，5，20-oxetanring結(jié)構(gòu)的非紫杉醇二萜類化合物（化合物1-7）;2、具有C-4，20 doublebond結(jié)構(gòu)的非紫杉醇二萜類化合物（化合物8-22）;3、具有12，16-Epoxytaxanes結(jié)構(gòu)（化合物23-26）、13

12、，16-Epoxytaxanes結(jié)構(gòu)（化合物27）、C-4，20 double bond oxygenated結(jié)構(gòu)（化合物43-45）、C-4，20 doublebond with C-12，17-epoxide結(jié)構(gòu)（化合物46）及C-11，12 seco-taxane with C4，20 double bond結(jié)構(gòu)（化合物47）的非紫杉醇二萜類化合物;4、具有3，11-cyclotaxanes結(jié)構(gòu)（化合物28-30）和Bicycli

13、c Taxoids結(jié)構(gòu)(化合物31-33)及2(3→20)abeotaxanes結(jié)構(gòu)（化合物34-42）的非紫杉醇二萜類化合物，應(yīng)用MTT比色法（與第一部分相同）進(jìn)行活性篩選。
　　 結(jié)果:具有4，5，20-oxetan ring結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物中1位碳原子連接較大取代基的化合物抗腫瘤活性較低，抗腫瘤活性隨羥基取代基數(shù)目的增加而增加;具有6/8/6母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物的抗腫瘤活性與C-5位連有的肉桂酰基側(cè)鏈有一定的相關(guān)性

14、;具有3，11-cyclotaxanes母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物抗腫瘤活性較強(qiáng);具有2(3→20) abeotaxanes和bicyclictaxoids母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物均顯示較弱的抗腫瘤活性;化合物(29)具有與紫杉醇極為相似的最小能量化三維立體構(gòu)象;紫杉烷類化合物(5)，(10)，(19)，(29)和(30)具有廣譜抗腫瘤活性。
　　 結(jié)論:抗人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活性不僅與紫杉烷類化合物的骨架結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而且該類化合物

15、抗人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活性可能還與C-5位具有的肉桂酰基側(cè)鏈以及化合物含有的羥基側(cè)鏈的數(shù)目有一定的相關(guān)性;紅豆杉中純化的非紫杉烷化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、10β-hydroxy-2α，9α，13α-triacetoxy-5α-cinnama-tetaxa-4(20),11-diene(10)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2α,10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phot

16、otaxicinⅡ(29)和2α,9α-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(30)不僅對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制活性，而且對(duì)其他實(shí)驗(yàn)婦科腫瘤細(xì)胞同樣具有較強(qiáng)的抑制活性。
　　 第三部分、9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧抗子宮內(nèi)膜癌作用機(jī)制研究癌癥治療的主要目的是選擇性摧毀腫瘤細(xì)胞。具細(xì)胞毒性的抗癌藥物可造成不可修復(fù)的DNA損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡，最終造成腫瘤細(xì)胞死亡。常用化療藥物抗腫瘤治療的機(jī)

17、制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。天然植物產(chǎn)物是抗癌活性成分的重要來源，這些成分多通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用。
　　 目的:前期研究發(fā)現(xiàn)從紅豆杉針葉中分離提取的化合物(29)即9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制活性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了化合物(29)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡及凋亡信號(hào)通路中重要蛋白表達(dá)量的影響，以期明確其抗癌機(jī)制。
　　 方法:1.TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡情況?；衔?29)終濃度為10μm

18、ol/L處理HEC-1細(xì)胞，24 h后棄去培養(yǎng)液，用TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，熒光顯微鏡下，觀察，拍照。2.流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)觀察化合物(29)作用HEC-1細(xì)胞后的凋亡情況。細(xì)胞傳代進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組加入10μmol/L的化合物(29)，空白對(duì)照組加入DMSO，于培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1×106/mL，取100

19、μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和10μL的PI溶液(20μg/mL)，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加400μL稀釋好的結(jié)合緩沖液，及時(shí)上流式細(xì)胞儀分析。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3.Western Blotting技術(shù)觀察化合物(29)作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后4種蛋白因子p53、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)變化情況。用直徑100 mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)HEC-1細(xì)胞，1×106個(gè)

20、，三枚加入化合物(29)，終濃度為2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L，一枚加入順鉑，終濃度為20μmol/L，一枚為對(duì)照組?；衔镒饔萌俗訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞48 h后，收集全細(xì)胞。裂解細(xì)胞后，聚丙烯凝膠電泳，牛奶封閉，轉(zhuǎn)膜，依次與一抗和二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影。4.利用MTT法檢測(cè)了半胱天冬酶抑制劑對(duì)化合物(29)抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用。使用0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L的化合物(29)處理

21、HEC-1細(xì)胞，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與化合物(29)共同孵育48h后，MTT法測(cè)定OD值。5.利用MTT法檢測(cè)了半胱天冬酶抑制劑對(duì)化合物(29)抑制其他婦科腫瘤細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用。使用5μmol/L的化合物(29)分別處理人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人卵巢透明囊腺癌細(xì)胞(SHIN3和HOC-21)及人透明癌細(xì)胞HAC-2，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與化合物(29)共同孵育48 h后，MTT法測(cè)定OD值。6.Wes

22、tern Blotting技術(shù)觀察化合物(29)作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后HSP90α的表達(dá)變化情況，具體方法同3.。
　　 結(jié)果:
　　 1.TUNEL染色顯示，經(jīng)化合物(29)作用24 h后的HEC-1細(xì)胞出現(xiàn)凋亡信號(hào)。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，10μmol/L的化合物(29)處理HEC-1細(xì)胞24 h后細(xì)胞早期凋亡率為31.7％，而對(duì)照組僅為4.7％。
　　 3.化合物(29)可顯著誘導(dǎo)HEC-

23、1細(xì)胞內(nèi)的p53、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，p53及Bax的表達(dá)量隨藥物濃度增加而增加，在處理24 h時(shí)p53表達(dá)量最高，化合物(29)各劑量組的Bax/Bcl-2的比值均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，5μmol/L及10μmol/L處理組出現(xiàn)caspase-3活化片段。
　　 4.使用0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L化合物(29)處理HEC-1細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為67.13％、35.

24、41％和1.87％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與化合物(29)共同孵育HEC-1細(xì)胞后，其細(xì)胞生存率分別上升為83.11％、40.15％和6.53％，且20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑可顯著翻轉(zhuǎn)1μmol/L和10μmol/L化合物(29)對(duì)HEC-1細(xì)胞增殖的抑制活性（P＜0.05）。
　　 5.20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑可顯著翻轉(zhuǎn)5μmol/L化合物(29)對(duì)HOC-21及HAC-2細(xì)胞增殖的抑制活性（

25、P＜0.05）。6.化合物(29)處理HEC-1細(xì)胞后胞內(nèi)HSP90α蛋白表達(dá)量降低，且10μmol/L處理組HSP90α的表達(dá)水平極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧(29)通過誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤活性。
　　 2.9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧(29)對(duì)人子宮內(nèi)膜癌的抗瘤活性機(jī)制與紫杉醇不同。
　　 3.9-去乙酰-3