東北紅豆杉(Taxus cuspidata)中紫杉烷類化合物抗腫瘤細胞增殖活性及其作用機制的研究.pdf

1、目前紫杉醇已成為世界上公認(rèn)的廣譜、強活性、抗癌藥物?，F(xiàn)今，人類獲得紫杉醇的方法大都停留在實驗室階段，由于收率低和提取工藝上尚存在一些困難，還不具備商業(yè)應(yīng)用價值，所以國際市場上至今仍沿用十年前確立的紫杉醇原料藥兩大制備方法（即紫杉樹皮提取法和樹枝提取一半合成法）。尋找新的生物資源，保護生態(tài)環(huán)境已迫在眉睫。目前對從紅豆杉屬植物中提取分離得到的新紫杉烷類藥物的研究主要是尋找具有較低毒副作用、較高抗腫瘤選擇性及對多種腫瘤細胞，尤其是對有抗藥性的

2、人體腫瘤細胞有較高生物活性的紫杉烷類化合物。
　　 目的：本研究的目的就是將從東北紅豆杉的可再生資源部位——小枝和針葉中分離純化得到的紫杉烷類化合物進行抗腫瘤細胞增殖活性的篩選，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法：1、應(yīng)用MTT比色法對從東北紅豆杉中選取的12種紫衫烷類化合物進行腫瘤細胞增殖抑制作用篩選。2、機制研究：采用腫瘤細胞增殖抑制試驗，以Taxol作為陽性對照，觀察Taxuspine F處理人腦神經(jīng)膠

3、質(zhì)瘤細胞24h后，再分別培養(yǎng)細胞1d、3d和5d，計數(shù)細胞濃度，繪制細胞增殖曲線以進行比較。3、通過電鏡技術(shù)觀察其形態(tài)學(xué)改變，初步探討了Taxuspine F抑制腫瘤細胞增殖的機制。
　　 結(jié)果：
　　 1、Ⅰ型紫杉烷類化合物對腫瘤細胞增殖的影響
　　 1.1具有I-a型結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物對腫瘤細胞增殖的影響
　　 用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L紫杉醇和順鉑處理后的HeLa細胞的

4、生存率分別為28％、22％、15％和81％、57％、34％，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系。而100μmol/L化合物Decinnamoytaxinine E（1）和5α，9α，10β，13α-Tetrahydroxy-4（20），11-taxadiene（4）處理后的HeLa細胞，顯示了較弱的抑制活性；2-Deacetyldecinnamoyltaxinine E（2）和Taxuspine F（3）不顯示任何抑制活性。此外，化合物1和2對人

5、子宮內(nèi)膜癌細胞、人卵巢透明癌細胞、人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、人肝癌細胞、人黑色素瘤細胞和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細胞不顯示任何抑制活性；化合物3和4僅對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞顯示較強的抑制活性，其IC50分別為8.43μmol/L和23.71μmol/L。
　　 1.2具有I-b型結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物對腫瘤細胞增殖的影響
　　 用100μmol/L紫杉醇和5α-DeacetylbaccatinⅠ（10）處理腫瘤細胞后，紫杉醇對各種腫瘤細胞均

6、顯示抑制活性，且與對照組相比均有顯著性差異，而化合物10均不顯示任何抑制活性。
　　 1.3具有I-c型結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物對腫瘤細胞增殖的影響
　　 分別用100μmol/L濃度的13-Aetyl-baccatinⅢ（5）、9-Dihydro-13-acetylbaccatinⅢ（6）、10-Deacetyl-13-acetylbaccatinⅢ（7）和10-Deacetyl-baccatinⅢ（8）處理HeLa細胞，

7、均顯示較強的抑制活性，其生存率分別為53.12％、49.38％、52.02％和44.17％；1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L濃度的7-（β-xylosyl）Taxol（9）均對HeLa細胞顯示強的抑制活性，其生存率分別為54.35％、41.89％和19.67％，低于順鉑，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系。此外，化合物8和9對人子宮內(nèi)膜癌細胞、人卵巢透明癌細胞、人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、人肝癌細胞、人黑色素瘤細胞和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細胞

8、的增殖不顯示任何抑制活性；化合物5和6僅對人卵巢透明癌細胞的增殖顯示較強的抑制活性，IC50分別為25.89μmol/L和20.38μmol/L；化合物7僅對人黑色素瘤細胞的增殖顯示較強的抑制活性，IC50為53.98μmol/L。
　　 2、具有Ⅳ型結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物對腫瘤細胞增殖的影響
　　 用100μmol/L濃度的紫杉醇、14β-BenzoyloxybaccatinⅣ（11）和Taxuspine N（12）處理

9、各種腫瘤細胞后，紫杉醇對各種腫瘤細胞的增殖均顯示抑制活性，而化合物11對各種腫瘤細胞的增殖均不顯示任何抑制活性，化合物12僅對人卵巢透明癌細胞（HOC-21）和人肝癌細胞（HLE）的增殖顯示較強的抑制活性，其細胞生存率分別為54.86％和57.14％。
　　 3、紫杉烷類化合物Taxuspine F（3）對T-98細胞生長曲線的影響
　　 采用細胞增殖實驗方法顯示，經(jīng)紫杉醇和紫杉烷類化合物Taxuspine F（3）的1

10、0μmol/L實驗組處理的T-98細胞在1d，3d，5d后計數(shù)的活細胞數(shù)分別為1.4×105cells/mL、2.9×105cells/mL、4.0×105cells/mL和5.2×105cells/mL、13.5×105cells/mL、15.1×105cells/mL，與對照組相比均有非常顯著性差異（P<0.01）。
　　 4、對被試瘤株細胞超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 T-98腫瘤細胞經(jīng)Taxuspine F（3）（10μ

11、mol/L）處理后發(fā)生超微結(jié)構(gòu)變化，通過透射電鏡觀察顯示如下：胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核明顯向外呈銳角狀突起、染色質(zhì)濃縮，密度增高，邊集于核膜下或呈新月體，核固縮，電子密度增高，核碎裂以及偶見凋亡小體形成等細胞凋亡現(xiàn)象。對照組腫瘤細胞未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：1 C4（20）為含氧三元環(huán)的紫杉烷類化合物對腫瘤細胞的增殖不顯示任何抑制作用，而C4-C20位有環(huán)外雙鍵或C4（20）-C5四元氧環(huán)的紫杉烷類化合物對腫瘤細胞的增殖

12、顯示較強的抑制作用。2 Taxuspine F（3）對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖顯示強的抑制作用；7-（β-xylosyl）Taxol（9）對人子宮頸癌細胞顯示強的抑制作用；13-Aetyl-baccatinⅢ（5）和9-Dihydro-13-acetylbaccatinⅢ（6）對人卵巢透明癌細胞的增殖顯示較強的抑制作用；Taxuspine N（12）對人卵巢透明癌細胞和人肝癌細胞的增殖顯示較強的抑制作用。3 Taxuspine F（3）