紅豆杉及菊科植物中萜類單體化合物抗肺癌活性篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、萜類化合物抗肺癌活性篩選
　　 萜類化合物紫杉醇(Taxol(R))是美國(guó)學(xué)者Dr. Wall最早于1971年從太平洋紅豆杉(Taxus brevifolia)的樹(shù)皮中分離得到的萜類抗腫瘤活性成分，1992年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了紫杉醇用于卵巢癌的治療，1994年又批準(zhǔn)其用于乳腺癌的治療，此后，紫杉醇很快應(yīng)用于多種常見(jiàn)惡性腫瘤，并取得了顯著的療效，成為抗癌的主要明星藥物，引起了腫瘤界的極大關(guān)注和期望。但是，紫杉醇取自紅豆杉的

2、樹(shù)皮，紅豆杉全世界僅有11種，分布范圍狹窄，生長(zhǎng)極為緩慢，加上紫杉醇在樹(shù)皮中的含量很低，這就大大地限制了紫杉醇的開(kāi)發(fā)利用。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)多種植物來(lái)源的萜類化合物進(jìn)行了抗肺癌活性篩選，目的是尋找有效的植物來(lái)源抗癌成分，以緩解紫杉醇對(duì)環(huán)境資源的破壞以及紫杉醇來(lái)源受限的局面。
　　 目的：為了緩解紫杉醇供不應(yīng)求的局面，尋找到活性更強(qiáng)毒性更小的化合物，本研究對(duì)東北紅豆杉和加拿大紅豆杉可再生針葉中提取純化得到的16種非紫杉醇二萜類化合物為

3、對(duì)象，對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性進(jìn)行了篩選，并進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性和結(jié)構(gòu)之間構(gòu)-效關(guān)系的探討。同時(shí)為了擴(kuò)大藥源，篩查更多的有效抗癌成分，本研究還對(duì)來(lái)自菊科植物中的18種倍半萜類化合物進(jìn)行了抗肺癌腫瘤細(xì)胞的活性篩選。
　　 方法：應(yīng)用MTT比色法進(jìn)行活性篩選。細(xì)胞接種于96孔板，每孔含1×104個(gè)細(xì)胞，分別加入溶劑對(duì)照(終濃度0.1％DMSO)、陽(yáng)性對(duì)照順鉑和各種實(shí)驗(yàn)用化合物，終濃度為100μmol/L、10μmol/L和1

4、μmol/L，每組設(shè)3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入5mg/mL MTT10μL。實(shí)驗(yàn)終止測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，測(cè)定波長(zhǎng)λ=570nm，參考波長(zhǎng)λ=630nm，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率或存活率。細(xì)胞增殖抑制率(％)=（1-給藥組OD值/對(duì)照組OD值）×100;細(xì)胞存活率(％)=（給藥組OD值/對(duì)照組OD值）×100;實(shí)驗(yàn)用化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，

5、計(jì)算實(shí)驗(yàn)用化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。
　　 結(jié)果：34種萜類化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞的增殖活性的篩選結(jié)果為：二萜類化合物taxinine(3)對(duì)實(shí)驗(yàn)用五種人肺腫瘤細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制活性，其中對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率在濃度為1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L時(shí)分別為23.81％，60.40％和90.18％；2α，10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin11(12)

6、和taxuspine A(16)除對(duì)RERF-LC-KJ細(xì)胞外的四種人肺腫瘤細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制活性，其中化合物12對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率在濃度為1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L時(shí)分別為18.31％，48.73％和68.19％；化合物16對(duì)A549細(xì)胞的增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為9.54μmol/L。倍半萜內(nèi)酯類化合物17（異土木香內(nèi)酯）、22（澤蘭內(nèi)酯）、23(3β，9β-diace

7、toxyiβ,10α-epoxy-11α,13-dihydrocostunolide)、29(achillinin A)和30(dehydrocostuslactone)對(duì)三種人非小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞的增殖均顯示較強(qiáng)的抑制活性，化合物32(dihydrodehydro-costuslactone)對(duì)QG-56細(xì)胞的增殖抑制率為90.75％;化合物22、23、29和30對(duì)人小細(xì)胞肺癌PC-6細(xì)胞的增殖均顯示較強(qiáng)的抑制活性，化合物17、22、2

8、3、29和30對(duì)人小細(xì)胞肺癌QG-90細(xì)胞的增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性。
　　 小結(jié)：從東北紅豆杉和加拿大紅豆杉中提取的3種二萜類化合物和從菊科植物中提取的5種倍半萜類化合物對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制活性；人肺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性不僅與紫杉烷類化合物的骨架結(jié)構(gòu)密切關(guān)系，而且該類化合物的抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性可能還與C-5位具有的肉桂?；鶄?cè)鏈密切相關(guān)。
　　 第二部分、異土木香內(nèi)酯體內(nèi)外抗癌活性及構(gòu)-效關(guān)系研究

9、>　　 菊科植物在我國(guó)資源豐富，富含倍半萜類化學(xué)成分，其結(jié)構(gòu)類型多，具有多種生物活性。土木香(Inula helenium)系菊科旋覆花屬植物，為多年生草本，從土木香中提取的單體化合物異土木香內(nèi)酯，具有抗結(jié)核、抗炎和抗腫瘤的效果。
　　 目的：為較系統(tǒng)地研究異土木香內(nèi)酯的抗腫瘤活性，并探討異土木香內(nèi)酯抗瘤活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)室采用體外培養(yǎng)的人小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞株和人非小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞株以及人多種其他器官由來(lái)的腫瘤細(xì)胞株對(duì)從土

10、木香的根中純化的六種倍半萜內(nèi)酯化合物進(jìn)行了體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)。為探討其對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，應(yīng)用MTT法對(duì)正常倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）抗增殖活性進(jìn)行觀察，并構(gòu)造裸鼠人肺癌A549移植性腫瘤模型，觀察異土木香內(nèi)酯體內(nèi)抗瘤活性及對(duì)體重和免疫器官脾的影響。
　　 方法：采用MTT比色法觀察異土木香內(nèi)酯對(duì)人多器官由來(lái)的腫瘤細(xì)胞及CHL的增殖抑制活性，具體方法與第一部分相同。利用人肺腺癌細(xì)胞A549裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，檢測(cè)異土木香內(nèi)酯體內(nèi)

11、抗人肺癌的效果。選取6-8周齡，體重18-22g之間雌性裸鼠，接種人肺腺癌細(xì)胞A549于裸鼠右前腋下，1周后腫瘤平均達(dá)6×6mm，隨機(jī)分為5組，每組6只。空白對(duì)照組：按照0.1mL/10g體重腹腔注射生理鹽水。陽(yáng)性對(duì)照組：給予順鉑干預(yù)，2mg/kg體重給藥，連續(xù)腹腔注射7天。實(shí)驗(yàn)組為異土木香內(nèi)酯，灌胃給藥，分為實(shí)驗(yàn)低劑量組：1mg/kg體重給藥；實(shí)驗(yàn)中劑量組：10mg/kg體重給藥；實(shí)驗(yàn)高劑量組：100mg/kg體重給藥；連續(xù)給藥10天

12、。于給藥后12天脫頸處死裸鼠，迅速剝離瘤塊及脾臟，稱重記錄。按照公式：腫瘤抑瘤率=（1-給藥組平均瘤重/空白對(duì)照組平均瘤重）×100％，計(jì)算藥物抑瘤率。按照公式：脾指數(shù)=平均脾重/平均體重×1000，計(jì)算脾指數(shù)。
　　 結(jié)果：異土木香內(nèi)酯作用于人肺癌細(xì)胞株，具有較強(qiáng)的抗細(xì)胞增殖作用，對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和QG-56增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為3.01μmol/L和9.39μmol/L，對(duì)人小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞(PC-

13、6和QG-90)的增殖抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照順鉑相同，與空白對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0．05)。異土木香內(nèi)酯對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251SP細(xì)胞增殖的IC50為10.55μmol/L，對(duì)人肝癌細(xì)胞株HLE和人黑色素瘤細(xì)胞株MM1-CB細(xì)胞的增殖均顯示明顯抑制作用，化合物2-Hydroxy-11，13-dihydroxy-isoalantolactone(20)、11α,13-Dihydroxyisoal anto-lactone(21)、

14、2α-hydroxy11α,13-dihydroisoalantolactone(25)、britannila ctone(27)和1-O-acetylbritannilactone(28)對(duì)本實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性，IC50均大于100μmol/L。用100μmol/L異土木香內(nèi)酯處理CHL細(xì)胞，對(duì)其增殖的抑制率為46.33％,異土木香內(nèi)酯對(duì)CHL的IC50大于100μmol/L。
　　 體內(nèi)抗人肺癌裸鼠模型實(shí)驗(yàn)，于實(shí)

15、驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠剝?nèi)×鲋?，稱取體重。空白對(duì)照組平均體重27.5g，平均瘤重0.53g；陽(yáng)性對(duì)照順鉑組平均體重為26.5g，平均瘤重0.42g；異土木香內(nèi)酯高劑量組（100mg/kg）、中劑量組（10mg/kg）、低劑量組(1mg/kg)平均體重分別為26.6g、27.0g和27.2g；平均瘤重分別為0.38g、0.44g和0.47g。抑瘤率分別為：順鉑組20.8％，實(shí)驗(yàn)藥物高劑量組為28.3％，中劑量組為17％，低劑量組為11.4％。各

16、組的裸鼠模型脾指數(shù)分別為：空白對(duì)照組5.81，順鉑組3.37，異土木香內(nèi)酯高劑量組5.19，中劑量組6.51，低劑量組5.12。
　　 小結(jié)：異土木香內(nèi)酯具有明顯的抗多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖活性，并具有濃度依賴性；異土木香內(nèi)酯具有明顯的體內(nèi)抗瘤活性，一定濃度下其抑瘤效果優(yōu)于順鉑，并對(duì)體重和脾臟沒(méi)有明顯的損傷作用；異土木香內(nèi)酯對(duì)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用低于順鉑；異土木香內(nèi)酯活性與其具有的α，β-不飽和五員內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，不飽和

17、的環(huán)外雙鍵氫化飽和后形成飽和五員內(nèi)酯環(huán)，可能是抗腫瘤活性消失或減弱的原因，A-環(huán)開(kāi)環(huán)可能是導(dǎo)致其體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用消失或減弱的另一原因。
　　 第三部分、異土木香內(nèi)酯抗肺癌作用機(jī)制研究
　　 離體和在體實(shí)驗(yàn)均已證明，許多抗癌藥物均可對(duì)不同類型的敏感瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，臨床上應(yīng)用的放療、熱療以及一些生物治療的目的也主要是引發(fā)細(xì)胞凋亡。中國(guó)傳統(tǒng)藥物中最近發(fā)現(xiàn)很多成分具有抗瘤作用，并且報(bào)道發(fā)現(xiàn)，這些成分多通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)

18、揮作用?；诖?，本實(shí)驗(yàn)對(duì)異土木香內(nèi)酯的抗瘤活性機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 目的：在發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯對(duì)肺癌細(xì)胞具有明顯抗增殖活性的基礎(chǔ)上，首先對(duì)其是否引起肺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行了研究，并對(duì)其作用于腫瘤細(xì)胞引起的細(xì)胞因子變化進(jìn)行了探討，以明確異土木香內(nèi)酯的抗肺癌活性機(jī)制。
　　 方法：1．吖啶橙(acridine orange，AO)染色觀察凋亡形態(tài)變化。用終濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L異土木香內(nèi)酯處理A

19、549細(xì)胞，48h后棄去培養(yǎng)液，滴加吖啶橙工作染液染色，熒光顯微鏡下用紫藍(lán)光激發(fā)濾片，觀察，拍照。2．流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)觀察異土木香內(nèi)酯作用A549細(xì)胞后凋亡情況和細(xì)胞周期變化。用直徑100mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549細(xì)胞，1×106個(gè)，三枚加入異土木香內(nèi)酯，終濃度為20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L，一枚為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，胰酶消化后收集細(xì)胞，加入10％雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與樣

20、品同步染色，加入碘化丙啶一步插入DNA熒光染色，以500目銅網(wǎng)過(guò)濾，采用美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測(cè)。3．DNA Ladder技術(shù)觀察凋亡DNA片段。用直徑60mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549細(xì)胞，3×105個(gè)，一枚為對(duì)照組，三枚加入異土木香內(nèi)酯，終濃度為5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集全細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后用酚氯仿法提取DNA，1％瓊脂

21、糖凝膠電泳，50V，2h。DNR MiniBIS Pro照相系統(tǒng)拍照。4．Western Blotting技術(shù)觀察異土木香內(nèi)酯作用肺癌細(xì)胞后7種蛋白因子Caspase-3、Bax、Bcl-2、HSP、Akt、P53及P21變化。用直徑100mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549細(xì)胞，1×106個(gè)，一枚為對(duì)照組，一枚加入順鉑，終濃度為20μmol/L，四枚加入異土木香內(nèi)酯，終濃度為5μmol/L、10μ.mol/L、20μmol/L和40μmol/L。

22、化合物作用人肺癌細(xì)胞48h后，收集全細(xì)胞。裂解細(xì)胞后，聚丙烯凝膠電泳，牛奶封閉，轉(zhuǎn)膜，依次與一抗和二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影。5．利用MTT法，檢測(cè)了半胱天冬酶抑制劑對(duì)異土木香內(nèi)酯抑制人肺癌細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用。使用1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的異土木香內(nèi)酯處理A549細(xì)胞，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與土木香內(nèi)酯共同孵育48h后，MTT法測(cè)定OD值。
　　 結(jié)果：1．吖啶橙染色顯

23、示，經(jīng)異土木香內(nèi)酯作用后的A549細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目減少，核染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜皺縮，并形成凋亡小體。2．經(jīng)異土木香內(nèi)酯處理A549細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，凋亡峰隨濃度升高而逐漸增加，異土木香內(nèi)酯在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L濃度時(shí)凋亡細(xì)胞比率分別為0.85％、0.82％、6.59％和15.32％。細(xì)胞周期分析顯示，隨異土木香內(nèi)酯濃度升高，G1期細(xì)胞數(shù)隨之升高，其他各期細(xì)胞數(shù)隨之降低，異土木香內(nèi)酯在0μm

24、ol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L濃度時(shí)處于G1期細(xì)胞比率分別為33.4％、37.7％、57.3％和60.2％。3．異土木香內(nèi)酯處理A549細(xì)胞后48h，瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)濃度在10μmol/L和20μmol/L時(shí)出現(xiàn)DNA梯狀條帶，并呈濃度依賴性。4．異土木香內(nèi)酯在濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L時(shí)處理A549細(xì)胞，48h后Akt、HSP90α無(wú)明顯變化，Caspase

25、-3、Bax、P53和P21隨藥物濃度增加而增加，Bcl-2則隨濃度降低，其中p53和p21具有時(shí)間依賴性，p53和p21在異土木香內(nèi)酯內(nèi)酯作用于A549細(xì)胞后12h、24h、48h逐漸升高。5．使用1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的異土木香內(nèi)酯處理A549細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為81.01％、31.03％、22.00％和13.96％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與土木香內(nèi)酯共同孵育A54

26、9細(xì)胞后，其細(xì)胞生存率分別上升為93.34％、68.76％、74.80％和70.14％，且20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑可顯著翻轉(zhuǎn)異土木香內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 小結(jié)：1異土木香內(nèi)酯通過(guò)誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗瘤活性，并使細(xì)胞停滯在G1期。2異土木香內(nèi)酯通過(guò)p53通路發(fā)揮抗人肺腺癌A549活性，使p53增高，順次促使p21升高，作用于Cdk，使細(xì)胞停滯在G1期；p53促進(jìn)Bax增高，Bcl-2抑

27、制，進(jìn)一步引起Caspase-3增高，引起細(xì)胞凋亡。各蛋白因子的變化都具有濃度依賴性，p53和p21具有時(shí)間依賴性。3異土木香內(nèi)酯對(duì)人肺腺癌A549抗瘤活性機(jī)制與紫杉醇不同，紫杉醇使A549細(xì)胞停滯在M期。4異土木香內(nèi)酯抗人肺腺癌A549機(jī)制與PI3K/Akt通路無(wú)關(guān)，與HSP90α無(wú)關(guān)。
　　 結(jié)論：1.三種二萜類化合物及五種倍半萜類化合物對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制活性，其活性與結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系。2.異土木香內(nèi)酯具有明顯的