miR-106a和miR-17-5p在反式二羥環(huán)氧苯并芘誘導細胞惡變中的作用.pdf

1、背景與目的:苯并[a]芘（B[a]P）是第一個被發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于環(huán)境中的環(huán)境化學致癌物，其經(jīng)代謝激活產(chǎn)生最終致癌物anti-BPDE后才具有致癌性。MiRNA是一類數(shù)量眾多的非編碼小RNA分子，能夠通過與靶基因的3’端非翻譯區(qū)配對結(jié)合引起翻譯抑制或mRNA的降解而起到癌基因或抑癌基因的作用。本研究中，利用anti-BPDE誘導的惡性轉(zhuǎn)化人類支氣管上皮細胞(16HBE-T)探討miRNA在化學致癌中的可能機制。使用qRT-PCR法測量mi

2、R-106a成熟體和miR-17-5p成熟體的表達水平，并進一步使用了特異的miRNA抑制劑和模擬物下調(diào)或上調(diào)惡性轉(zhuǎn)化細胞里的miR-106a或miR-17-5p活性，以此來確定其表達高低對惡性轉(zhuǎn)化細胞生物學特性的影響。
　　 結(jié)果顯示，與對照細胞相比(16HBE-N)，miR-106a和miR-17-5p在惡性轉(zhuǎn)化細胞中存在過度表達。轉(zhuǎn)染抑制劑沉默16HBE-T細胞的miR-106a或miR-17-5p后會抑制細胞增殖、誘導細

3、胞周期阻滯和凋亡、抑制非依賴性生長。相反，轉(zhuǎn)染模擬物上調(diào)16HBE-T細胞中的miR-106a或miR-17-5p水平后細胞表現(xiàn)出完全相反的特性。此外，對miR-106a還進行了裸鼠實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射了轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑的細胞的腫瘤組生長速度明顯減緩，而注射了轉(zhuǎn)染miR-106a模擬物的細胞的腫瘤組生長速度顯著增快。這些結(jié)果表明miR-106a和miR-17-5p在化學致癌劑誘導的轉(zhuǎn)化中可能起到癌基因的作用。因此，敲除惡變細胞

4、中的miR-106a和miR-17-5p可能是一種潛在的治療方法。
　　 方法:
　　 1.檢測miRNA的表達
　　 使用TaqMan MicroRNA assays試劑盒鑒定16HBE-N和16HBE-T細胞中miRNA的表達水平。
　　 2.瞬時轉(zhuǎn)染miRNA模擬物和抑制劑
　　 按照Lipofectamine 2000說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。模擬物轉(zhuǎn)染組設試驗組（miR-106a mimic和

5、miR-17-5p mimic）和陰性對照組（mimic NC），抑制劑轉(zhuǎn)染組設試驗組（anti-miR-106a和anti-miR-17-5p）和陰性對照組（inhibitor NC），此外，還設置了轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000陰性對照組（Lipo-2000 NC）。轉(zhuǎn)染5小時后評價轉(zhuǎn)染效率，72小時后檢測miRNA表達水平改變情況。
　　 3.細胞周期實驗
　　 轉(zhuǎn)染72小時后，用PI和Rnase A

6、著色，以流式細胞儀分析細胞周期。
　　 4.細胞增殖實驗
　　 在96孔板里接種相同數(shù)量的16HBE-T細胞后，培養(yǎng)24小時，再分組進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后第五天用CCK-8試劑和酶標儀檢測細胞的增殖能力。
　　 5.凋亡實驗
　　 轉(zhuǎn)染72小時后，使用Annexin V/PI試劑盒和流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染細胞的凋亡率。
　　 6.軟瓊脂實驗
　　 將500個細胞重懸于1ml 0.3％低熔點

7、瓊脂糖，然后鋪到已含1ml 0.6％半固體低熔點瓊脂糖的12孔板里。低熔點瓊脂糖用含10％血清的培養(yǎng)基配置。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后，計算克隆數(shù)。
　　 7.裸鼠試驗
　　 轉(zhuǎn)染24小時后，收集轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染組細胞，用PBS重懸細胞使細胞密度為1×107個/ml，取0.2 ml皮下注射入5周齡的BALB/c裸鼠后腿內(nèi)側(cè)。成瘤后每五天測量腫瘤體積繪制生長曲線，飼養(yǎng)42天后，處死裸鼠，取出腫瘤稱重、4％甲醛固定后進行病理鑒定。<

8、br>　　 8.統(tǒng)計分析
　　 各實驗組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。滿足正態(tài)分布且方差齊同的兩組間miRNA表達差異的比較，采用兩組獨立樣本的t檢驗；三組以上的比較采用方差分析，組間兩兩比較方差齊同時采用LSD-t檢驗。不滿足正態(tài)分布時采用非參數(shù)檢驗。顯著性水平a=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.16HBE-T細胞中miR-106a和miR-17-5p過表達
　　 1

9、6HBE-T細胞中的miR-106a成熟體和miR-17-5p成熟體表達水平分別是16HBE-N的2.9±0.2倍和2.3±0.1倍（P<0.05）。
　　 2.1 6HBE-T細胞轉(zhuǎn)染后miRNA表達改變
　　 與16HBE-T相比，轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑或模擬物后miR-106a表達水平分別為0.3±0.1和1.9±0.3倍（P<0.05），轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑或模擬物后miR-17-5p表達水平分別為0

10、.4±0.1和1.7±0.2倍（P<0.05）。
　　 3.轉(zhuǎn)染后細胞周期分布改變
　　 與inhibitor NC組比較，anti-miR-106a組和anti-miR-17-5p組均出現(xiàn)G0/G1期細胞比例增多、S期細胞比例減少（P<0.05）。與mimic NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-106a mimic后G0/G1期細胞比例減少，S期細胞比例增多（P<0.05）。
　　 4.轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力改變
　　

11、 與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑或模擬物后細胞的增殖能力分別降低了0.37±0.01和升高了0.45±0.07倍（P<0.05），轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑或模擬物后細胞增殖能力分別降低了0.29±0.03倍和升高了0.34±0.02倍（P<0.05）。
　　 5.轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率改變
　　 抑制劑試驗組比抑制劑對照組出現(xiàn)更高的凋亡率（P<0.05），而各陰性對照組與未轉(zhuǎn)染組相比，凋亡率差別。同時，模擬物試

12、驗組與模擬物對照組相比凋亡率大幅下降（P<0.05）。
　　 6.轉(zhuǎn)染后細胞集落形成率改變
　　 抑制劑試驗組比抑制劑對照組和未處理組細胞出現(xiàn)更少的克隆數(shù)（P<0.05）。而模擬物試驗組與模擬物對照組相比克隆數(shù)增多（P<0.05）。
　　 7.裸鼠實驗
　　 在6種處理組中，anti-miR-106a組的腫瘤生長速度最慢（P<0.05），miR-106a mimic組的腫瘤生長速度最快（P<0.05），而

13、16HBE-T組、Lipo-2000 NC組、inhibitor NC組、mimic NC組的腫瘤生長速度無明顯差別。接種42天后收獲腫瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，anti-miR-106a組的腫瘤平均重量(35.7±9.6mg)明顯低于inhibitor NC組的腫瘤平均重量 (110.8±15.3 mg)(P<0.05)。miR-106a mimic組的腫瘤平均重量(340.4±23.1 mg) 明顯高于mimic NC組的腫瘤平均重量(127.

14、6±21.9 mg)(P<0.05)。經(jīng)病理學鑒定發(fā)現(xiàn)，注射此6種細胞的小鼠均生長出鱗狀細胞癌。
　　 結(jié)論:
　　 1．Anti-BPDE誘導惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細胞16HBE-T存在miR-106a和miR-17-5p成熟體表達上調(diào)。
　　 2．miR-106a和miR-17-5p成熟體表達水平改變能夠影響16HBE-T細胞生物學特性。
　　 3．miR-106a和miR-17-5p在環(huán)境化學致癌劑